Ⅰ. Introduction
La plupart des bactéries n'ont pas de couleur, donc elles génèrent peu de contraste dans le champ du
microscope. Par
conséquent, pour voir les bactéries au microscope, il est nécessaire d'appliquer de la couleur en
utilisant
un réactif
de coloration. Une fois colorées, les bactéries peuvent être observées et étudiées par rapport à
leur forme,
leur taille
et leur disposition.
Un frottis bactérien est une fine couche de bactéries placée sur une lame de verre et «fixées» par la chaleur ou autres, en partie pour s'assurer qu'elles restent attachées au verre, pour la coloration. Il peut être préparé à partir d'un milieu solide ou de bouillon
Ensuite, une coloration est appliquée. La surface et le cytoplasme des
cellules bactériennes
,
l’ADN, l’ARN, les protéines et la
chromatine sont chargés négativement (acide) pour les colorer un colorant
chargé
positivement (basique) est appliqué (bleu
de méthylène, fuchsine basique, cristal violet, safranine, vert de
malachite....).
Ⅱ. Considérations générales
Il y a des choses importantes à considérer lors de la préparation d'un frottis pour la coloration:
- Les bactéries doivent être uniformément et légèrement dispersées.
- Les bactéries doivent être fermement attachées à la lame afin de ne pas être lavées pendant les
procédures de
coloration.
- Il est très facile de ne pas savoir de quel côté de la lame se trouve le frottis. Veillez à
étiqueter le bord le plus éloigné de la diapositive.
- Laisser sécher votre lame à l'air avant que vous la fixez à la chaleur (les bactéries
bouilliront et la morphologie cellulaire sera perdue)
Ⅲ. Réalisation des frottis
❶ Étalement des frottis
Dégraisser la surface d'une lame de verre
avec
de l'alcool
sur un bec
Bunsen, la
déposer
sur un
support de coloration avec la surface dégraissée vers le haut, laisser refroidir :
À partir des cultures
- Si vous travaillez à partir d'un milieu solide, placez une goutte
d'eau dans une zone sur la lame. Si vous utilisez un bouillon
moyen, aucun liquide
supplémentaire
n'est nécessaire.
- Avec votre boucle d'inoculation, mélangez
complètement l'échantillon (colonies bactériennes) avec l'eau et étalez le mélange pour couvrir
environ la moitié de la
surface totale de la lame.
À partir des écouvillons (prélèvement)
- Les frottis ne doivent pas être préparés à partir d'un écouvillon après avoir été utilisé pour
inoculer les milieux
de culture. Idéalement, si l'échantillon ne peut être prélevé que sur des écouvillons, deux
écouvillons sont soumis.
- Les frottis des écouvillons sont préparés en faisant rouler l'écouvillon d'avant
en arrière
(L'écouvillon ne doit
jamais être frotté , les éléments de frottis pourraient être brisés) sur les zones
contiguës de
la
lame de verre
pour déposer une fine couche de matériau échantillon . Cela préserve la morphologie
et les
relations
des
micro-organismes et des éléments cellulaires.
À partir de liquides épais ou semi-solides
- Les écouvillons peuvent également être utilisés comme outil pour la préparation de frottis à
partir
d'échantillons
liquides épais ou semi-solides tels que les matières fécales.
- L'écouvillon est immergé dans l'échantillon pendant plusieurs secondes, puis utilisé
pour
préparer
une fine couche
de matériau sur la lame de verre pour la coloration et la visualisation. Cette méthode
de
préparation par écouvillon
est adéquate mais peut produire des résultats moins souhaitables que d'autres
méthodes.
❷ Séchage et fixation des frottis
- Le séchage doit précéder la fixation. Doit se faire autant que possible à la température du
laboratoire, a la rigueur en posant la lame sur une platine chauffante réglée à 37°, ou en la
maintenant dans l'air chaud au-dessus de la veilleuse d'un bec Bunsen.
NB : Des précautions doivent être prises pour éviter une chaleur
extrême car une déformation de la cellule et des éclaboussures peuvent se produire (altération
de certains constituants, en particulier la paroi bactérienne).
- La «fixation» d'un échantillon fait référence au processus de fixation
de
cellules sur une
lame. La
fixation est
souvent obtenue soit par chauffage (EX : en passant rapidement la lame
trois
fois à travers le bec Bunsen
), soit par traitement
chimique de
l'échantillon. En
plus de fixer
l'échantillon à la lame, la fixation tue également les micro-organismes dans l'échantillon, arrêtant
leur mouvement
et leur métabolisme tout en préservant l'intégrité de leurs composants cellulaires pour
l'observation.
