Techniques d’ensemencement et d’isolement des bactéries

Afin de pouvoir identifier une espèce bactérienne de façon convenable, il faut obtenir des colonies bien isolées. Le principe est d’épuiser un dépôt initial en faisant des étalements successifs dans différentes directions ( d’où le nom de la technique : épuisement par la méthode des quadrants ).

Plusieurs techniques sont couramment appliquées : 3, 4 ou 5 étalements successifs

Ⅰ. Principe de l'ensemencement

L'ensemencement en quadrants (à usage général) est utile pour la plupart des échantillons. Le nombre relatif d'organismes peut être estimé en fonction de l'étendue de la croissance au-delà de la zone d'origine de l'inoculum.

☰ Les étapes

Assurez-vous que le contenu du tube (bouillon ou suspension de culture) est mélangé uniformément.
Placer une anse de bouillon de culture sur la surface d'une boite de gélose , près du bord mais sans le toucher. Avec la boucle à plat contre la surface de la gélose, rayez légèrement l'inoculum (voir photo :❶) ; ne pas déterrer la gélose.
Stérilisez la boucle et laissez-la refroidir à l'air.
Tournez la boite ouverte dans votre main gauche de manière à pouvoir tracer une série de quatre lignes d'avant en arrière, chacune passant à travers l'inoculum et s'étendant sur un côté de la boite (❷).
Stérilisez à nouveau la boucle et laissez-la refroidir à l'air.
Faites pivoter la plaque et tracez une autre série de quatre lignes, chacune croisant l'extrémité des quatre dernières lignes et s'étendant sur le côté adjacent de la boite (❸).
Tournez la plaque et répétez cette rayure parallèle une fois de plus.
Enfin, faites quelques stries au centre intact de l'assiette. Ne touchez pas l'inoculum d'origine (❹).
Incuber la plaque (inversée) à 35°C.

Ⅱ. Ensemencement Semi-quantitative

Certains spécimens, comme les urines, nécessitent une technique quantitative pour déterminer le nombre de bactéries présentes.

Les boites sont inoculées à l'aide d'une boucle calibrée pour délivrer un volume spécifié. L'urine est bien mélangée et la boucle calibrée (1 ou 10 µl) est insérée dans l'urine et transférée dans le milieu de culture en effectuant une seule raie au centre de la plaque. Sans flamber, la boucle est striée d'avant en arrière à travers l'inoculum d'origine.

Le lendemain, compter le nombre de colonies à la surface de chaque milieu. Chaque colonie poussant sur la boite de gélose représente une unité formant colonie (ufc)/µL (selon la taille de la boucle), ce qui équivaut à 1000 cfu/mL. N'oubliez pas que la gélose nutritive est le principal milieu utilisé pour compter les colonies.

« Exemple »

10 Colonies avec une boucle de 1µl correspondent à 10⁴ ufc/mL
10 Colonies avec une boucle de 10µl correspondent à 10³ ufc/mL

☰ boucle d'inoculation bactériologique

öse (ou boucle ou loop ou anse) , la boucle d'inoculation est un outil portatif qui se termine par une petite boucle métallique. La boucle peut être utilisée pour étaler des micro-organismes sur gélose dans une boîte de Pétri ou pour les transférer d'un tube à essai à un autre. Avant chaque utilisation, l'anse d'inoculation doit être stérilisée afin que les cultures ne soient pas contaminées.