Afin de pouvoir identifier
une
espèce bactérienne de façon
convenable, il faut obtenir des colonies
bien
isolées.
Le principe est d’épuiser un dépôt initial en faisant des étalements successifs dans différentes
directions
( d’où le nom de la technique : épuisement par la méthode des quadrants ).
Plusieurs techniques sont
couramment appliquées : 3, 4 ou 5 étalements successifs
Ⅰ. Principe de
l'ensemencement
L'ensemencement en quadrants (à usage général) est utile pour la plupart des
échantillons. Le
nombre relatif d'organismes peut être estimé en fonction de l'étendue de la croissance au-delà
de
la zone d'origine de l'inoculum.
☰ Les étapes
- Assurez-vous que le contenu du tube (bouillon ou suspension de culture) est
mélangé
uniformément.
- Placer une anse
de bouillon de culture sur la surface d'une boite
de gélose ,
près
du bord mais sans le toucher. Avec la boucle à plat contre la surface de la gélose,
rayez
légèrement l'inoculum (voir photo :❶) ; ne
pas déterrer la gélose.
- Stérilisez la boucle et laissez-la refroidir à l'air.
- Tournez la boite ouverte dans votre main gauche de manière à pouvoir tracer une
série de
quatre lignes d'avant en arrière, chacune passant à travers l'inoculum et s'étendant
sur
un côté
de la boite (❷).
- Stérilisez à nouveau la boucle et laissez-la refroidir à l'air.
- Faites pivoter la plaque et tracez une autre série de quatre lignes, chacune
croisant
l'extrémité des quatre dernières lignes et s'étendant sur le côté adjacent de la
boite (❸).
- Tournez la plaque et répétez cette rayure parallèle une fois de plus.
- Enfin, faites quelques stries au centre intact de l'assiette. Ne touchez pas
l'inoculum
d'origine (❹).
- Incuber la plaque (inversée) à 35°C.
Ⅱ. Ensemencement Semi-quantitative
Certains spécimens, comme les urines, nécessitent une technique quantitative pour
déterminer
le nombre de
bactéries
présentes.
Les boites sont
inoculées à
l'aide d'une
boucle calibrée pour délivrer un volume spécifié. L'urine est bien mélangée et la
boucle
calibrée
(1 ou 10 µl)
est insérée dans l'urine et transférée dans le milieu de culture en effectuant une seule
raie au
centre de la
plaque. Sans flamber, la boucle est striée d'avant en arrière à travers l'inoculum
d'origine.
Le lendemain, compter le nombre de colonies à la surface de chaque
milieu. Chaque colonie
poussant sur la boite de gélose représente une unité formant colonie (ufc)/µL (selon la
taille de la boucle), ce qui équivaut à 1000 cfu/mL. N'oubliez pas que la gélose
nutritive est le principal milieu utilisé pour compter les colonies.
« Exemple »
- 10 Colonies avec une boucle de 1µl correspondent à 104 ufc/mL
- 10 Colonies avec une boucle de 10µl correspondent à 103 ufc/mL
☰ boucle d'inoculation bactériologique
öse (ou boucle ou loop ou anse) , la boucle d'inoculation est un outil portatif qui
se termine par
une
petite boucle métallique. La
boucle peut être
utilisée pour étaler des micro-organismes sur gélose dans une boîte de Pétri ou pour les transférer
d'un tube à
essai à un autre.
Avant chaque utilisation, l'anse d'inoculation doit être stérilisée afin que les cultures ne soient
pas contaminées.
