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L'antibiogramme, également appelé test de sensibilité aux antibiotiques, est un test de laboratoire réalisé pour évaluer la réponse des bactéries aux antibiotiques. Cet article explique ce qu'est un antibiogramme, décrit son principe, ses différents types et ses étapes de réalisation
◉ Definition
Le test de sensibilité aux antibiotiques, ou antibiogramme, est un test in vitro qui détermine la sensibilité ou la résistance des bactéries à des antibiotiques spécifiques.
Il est réalisé en exposant le micro-organisme à différents antibiotiques dans un environnement de laboratoire contrôlé pour évaluer leur efficacité à inhiber ou à tuer les bactéries.
Les résultats des tests de sensibilité aux antibiotiques aident les cliniciens à choisir le ou les antibiotiques les plus efficaces pour traiter une infection bactérienne.
L'antibiogramme joue également un rôle crucial dans la surveillance des modèles de résistance bactérienne. En évaluant la sensibilité ou la résistance des bactéries à divers antibiotiques, il fournit des données précieuses sur la prévalence et les tendances de la résistance aux antibiotiques dans une population ou une zone géographique particulière.
◉ Méthodes et Types
Il existe plusieurs méthodes et techniques disponibles pour évaluer la sensibilité des bactéries aux antibiotiques:
- Méthode de diffusion (méthode Kirby-Bauer) : des disques d'antibiotiques sont placés sur une boite de gélose avec des bactéries. La zone d'inhibition autour de chaque disque est mesurée et comparée à des critères d'interprétation.
- Méthode de microdilution en bouillon : des dilutions en série d'antibiotiques sont préparées dans des plaques de microtitration. Une suspension bactérienne est ajoutée et la CMI est déterminée comme la concentration la plus faible inhibant la croissance visible (CMI en milieu liquide).
- Méthode Etest : des bandelettes avec un gradient de concentrations d'antibiotiques sont placées sur des plaques de gélose (Etest)
- Systèmes automatisés : la croissance ou l'inhibition bactérienne est mesurée à l'aide de méthodes optiques ou colorimétriques, les résultats étant interprétés par un logiciel.
- Méthodes moléculaires : la PCR ou le séquençage de l'ADN détecte des gènes ou des mutations spécifiques de résistance.
◉ Principe
Les principes de l'antibiogramme reposent sur l'évaluation de la capacité des antibiotiques à inhiber la croissance des bactéries ou à les tuer.
- Un inoculum standardisé de bactéries (le plus souvent 0.5Mcf) est tamponné sur la surface d'une boite de gélose Mueller-Hinton (MH).
- Des disques de papier filtre imprégnés d'agents antimicrobiens sont placés sur la gélose.
- Après une nuit d'incubation, le diamètre de la zone d'inhibition est mesuré autour de chaque disque.
- En se référant aux tableaux de la norme CLSI ou EUCAST, on obtient un rapport qualitatif de sensible, intermédiaire ou résistant.
◉ Quel milieu pour antibiogramme ?
🏾 Le milieu de culture doit permettre la croissance de nombreuses bactéries et il ne doit pas contenir d'inhibiteurs des antibiotiques:
- La teneur en calcium et en magnésium doit être contrôlées, car excès de cations bivalents (Ca2+, Mg2+) inhibent l'action des polymyxines.
- Un pH trop acide augmente l'activité des ß-lactamines, un milieu alcalin favorise les aminosides et les macrolides, il doit être compris entre 7,2 et 7,4, valeur qui permet une bonne croissance bactérienne et qui réalise un compromis pour l'activité des antibiotiques.
🏾 Le milieu retenu pour la majorité des espèces bactériennes est celui de Mueller-Hinton (plus 5% de sang pour les germes exigeants):
- Il montre une reproductibilité de lot à lot acceptable pour les tests de sensibilité.
- Il est faible en inhibiteurs qui affectent les résultats des tests de sensibilité au sulfonamide, au triméthoprime et à la tétracycline.
- Il favorise une croissance satisfaisante de la plupart des agents pathogènes.
- Un grand nombre de données et d'expérience ont été collectées sur les tests de sensibilité effectués avec ce milieu.
🏾 Il doit être coulé en boîtes de Petri sur une épaisseur de 4 mm et les géloses doivent être séchées avant l'emploi.
NOTE:
Certaines espèces exigeantes, telles que Haemophilus spp., Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae et viridans et les streptocoques β-hémolytiques ne se développent pas suffisamment sur MH-agar non supplémenté (nécessitent des suppléments ou des milieux différents).
Si, juste avant utilisation, un excès d'humidité de surface est présent sur les plaques, placez-les dans un incubateur (35°C) ou une hotte à flux laminaire à température ambiante avec les couvercles entrouverts jusqu'à ce que l'excès d'humidité de surface soit éliminé par évaporation (généralement 10 à 30 minutes ).
◉ Les disques d'antibiotiques
🏾 Les disques d'antibiotiques sont fabriqués à partir de papier absorbant de qualité supérieure imprégnés d'agents antimicrobiens à des concentrations précises. Ils sont clairement identifiés par un sigle, comportant 1 à 3 lettres, imprimé de chaque côté du disque
🏾 Les cartouches de disques doivent être conservées dans leur container entre +2 et +8°C au sec.les disques doivent être amenés à température ambiante. Toute cartouche ouverte doit être utilisée dans les cinq jours.
| Sigle | Antibiotique | Famille | Charge du disque (µg) |
|---|---|---|---|
| AM | Ampicilline | Aminopénicilline | 10 |
| ATM | Aztréonam | Monobactame | 30 |
| GM | Gentamicine | Aminosides | 10 |
| ETP | Ertapénème | Carbapénème | 10 |
🏾 Toutes les abréviation de disques d'antibiotiques
🏾 L'antibiotique contenu dans le disque se solubilise dans l'eau de la gélose. Sa diffusion peut-être schématiquement présentée en deux étapes:
- Une diffusion verticale (en profondeur) dans le milieu contenu dans le cylindre délimité par le disque pré-imprégné
- Une diffusion horizontale (latéralement) qui répartit l'antibiotique selon un gradient de concentrations dont le maximum est situé au niveau du disque
◉ Taille de l'inoculum '0.5 MF'
La suspension cellulaire doit être préparée dans de l'eau physiologique stérile à partir d'une culture jeune et pure sur milieu d'isolement approprié. Dans le cas de Neisseria gonorrhoeae, la suspension est préparée dans du tampon phosphate stérile à pH 7,2.
Elle doit être ajustée à l'aide d'un photomètre ou par comparaison avec un étalon d'opacité (échelle de McFarland).En Algérie, l'antibiogramme par diffusion est réalisé avec une suspension calibrée à 0,5 MF ou à une D.O. de 0,08 à 0,10 lue à 625 nm contenant environ 108 bactéries par ml.Ce nombre est porté à 109 pour Helicobacter pylori équivalente au standard McFarland 3.
☰ Préparation de l'étalon de turbidité 0,5 McFarland
| 1 | Ajouter 0,5 mL d'une solution à 0,048 mol/L de BaCl 2 (1,175% p/v BaCl 2 ·2H20) à 99,5 mL d'une solution 0,18 mol/L (0,36 N) de 2 S0 4 (1% v/v) et agiter vigoureusement |
|---|---|
| 2 | Vérifier la densité de la suspension à l'aide d'un spectrophotomètre avec un faisceau de 1 cm et des cuvettes assorties. L'absorbance à 625 nm doit être comprise entre 0,08 et 0,13. |
| 3 | Distribuer la suspension dans des tubes de même taille que ceux utilisés pour ajuster l'inoculum. Sceller les tubes. |
| 4 | Une fois scellés, conserver ces tubes à température ambiante et à l'abri de la lumière. Avant usage, mélanger vigoureusement le tube à l'aide d'un Vortex (6 mois de conservation.). |
◉ Ensemencement d'antibiogramme
🏾 l'ensemencement doit se faire dans les 15 minutes qui suivent la préparation de l'inoculum. Il est réalisé par écouvillonnage ou par inondation de telle façon à avoir après incubation des colonies distinctes mais jointives.
- Plonger l 'écouvillon dans la suspension et éliminer l 'excès de liquide en tournant l 'écouvillon sur les parois du tube.
- Frotter la surface entière de la boite d'agar trois fois, en faisant tourner la boite d'environ 60 ° C entre les stries pour assurer une distribution uniforme. Pour minimiser les aérosols, évitez de heurter les côtés de la plaque. Enfin, passez un tampon sur le bord de la gélose pour éliminer tout excès d'humidité.
◉ Application des disques
- 1. Appliquer des disques sur la surface d'agar avec un distributeur ou manuellement avec une pince stérile.
- 2. Appliquer une légère pression avec une pince ou une aiguille stérile pour assurer un contact complet du disque avec la gélose (certains distributeurs le font automatiquement).
- 3. Déposer les disques d'antibiotique sur la gélose (maximun 6 disques sur boîte de pétri de 9 cm de dimètre)
- 4. Incubation rapide dans les 15 minutes qui suivent le dépôt des disque (au delà de 30 minutes les zones d 'inhibition seront faussement agrandies). Incubation 16-24 heures à 35±2°C en aérobiose (sauf cas cités plus haut sous atmosphère enrichie en Co2 ou micro-aérobiose).
NOTE: Parce qu'une partie du médicament se diffuse presque instantanément, un disque ne doit pas être déplacé une fois qu'il a été en contact avec la surface de la gélose. Au lieu de cela, placez un nouveau disque dans un autre emplacement sur la gélose.
◉ Incubation de l'antibiogramme
Retourner les boîtes et les incuber idéalement dans les 15 min. qui suivent le dépôt des disques, sans dépasser 30 min. Si elles sont abandonnées à température ambiante après dépôt des disques, la pré-diffusion des antibiotiques engendrera des zones d'inhibition faussement agrandies
◉ Lecture et interpretation de l'antibiogramme
- L'arrêt de la croissance à distance du disque se produit en présence de la concentration minimale inhibitrice de l'antibiotique
- Le diamètre de la zone d'inhibition correspond donc à la CMI de l'antibiotique.
- Il faudrait comparer la CMI aux concentrations critiques inférieure et supérieure afin de déterminer les caractères sensible, intermédiaire ou résistant de la bactérie vis-à-vis de cet antibiotique
- Grâce à la droite de concordance, déterminer la sensibilité et la résistance revient pour un antibiogramme réalisé dans les conditions standards à comparer le diamètre d'inhibition mesuré (∅ mesuré) et les diamètres critiques d(CCsup) et D(CCinf).
| ∅ mesuré ≥ D(CCinf) | Sensible (S) |
|---|---|
| ∅ mesuré < d(CCsup) | Résistant (R) |
| d(CCsup) ≤ ∅ mesuré < D(CCinf) | Intermédiaire (I) |
🏾 Après 16 à 18 heures d'incubation, examinez chaque plaque. Si la plaque a été striée de manière satisfaisante et que la concentration d'inoculum est correcte, les zones d'inhibition résultantes seront uniformément circulaires et il y aura une pelouse de croissance confluente.
- Si des colonies individuelles sont apparentes, la concentration de l'inoculum était trop légère et le test doit être répété.
🏾 Mesurer les diamètres des zones d'inhibition complète (comme jugé à l'œil nu), y compris le diamètre du disque. Mesurez les zones au millimètre entier le plus proche, à l'aide d'étriers coulissants ou d'une règle.
🏾 Comparer le diamètre d'inhibition mesuré (∅ mesuré) et les diamètres critiques d(CCsup) et D(CCinf) selon CLSI "Clinical & Laboratory Standards Institute" ou EUCAST
| ∅ mesuré ≥ D(CCinf) | Sensible (S) |
|---|---|
| ∅ mesuré < d(CCsup) | Résistant (R) |
| d(CCsup) ≤ ∅ mesuré < D(CCinf) | Intermédiaire (I) |
Lecture d'antibiogramme