Ⅰ. Definition et
Principe
🏾 L’antibiogramme est un test in vitro de sensibilité d’un germe
à
un ou plusieurs
antibiotiques par la technique de diffusion sur milieux gélosé.
Il a pour but de guider le clinicien dans le choix d’un antibiotique pour traiter une
infection bactérienne, d’exploitées les données pour la surveillance des résistances
bactériennes aux antibiotiques
Principe : Un inoculum standardisé de bactéries (le plus souvent 0.5Mcf) est
tamponné
sur la surface d'une boite de gélose Mueller-Hinton
(MH). Des disques de papier filtre imprégnés d'agents
antimicrobiens sont placés sur la gélose. Après une nuit d'incubation, le diamètre de la
zone
d'inhibition
est mesuré autour de chaque disque. En se référant aux tableaux de la norme CLSI ou EUCAST, on
obtient un rapport qualitatif de sensible,
intermédiaire ou résistant.
Ⅱ. Quel milieu pour antibiogramme ?
🏾 Le milieu de culture doit permettre la croissance
de
nombreuses bactéries et il ne
doit pas contenir d'inhibiteurs des antibiotiques:
- La teneur en calcium et en magnésium
doit être contrôlées, car excès de cations bivalents (Ca2+, Mg2+) inhibent l'action des
polymyxines.
- Un pH trop acide augmente l'activité des ß-lactamines, un milieu alcalin
favorise les aminosides et les macrolides, il doit être compris entre 7,2 et 7,4, valeur qui
permet une bonne croissance bactérienne et qui réalise un compromis pour l'activité des
antibiotiques.
🏾 Le milieu retenu pour la majorité des espèces bactériennes est celui de Mueller-Hinton
(plus 5% de sang pour les germes exigeants):
- Il montre une reproductibilité de lot à lot acceptable pour les tests de sensibilité.
- Il est faible en inhibiteurs qui affectent les résultats des tests de sensibilité au
sulfonamide, au
triméthoprime et à la tétracycline.
- Il favorise une croissance satisfaisante de la plupart des agents pathogènes.
- Un grand nombre de données et d'expérience ont été collectées sur les tests de sensibilité
effectués
avec ce milieu.
🏾 Il doit être coulé en boîtes de Petri
sur une épaisseur de 4 mm et les géloses doivent être séchées avant l’emploi.
NOTE:
Certaines espèces exigeantes, telles que Haemophilus spp., Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae et viridans et les streptocoques β-hémolytiques ne se développent pas suffisamment sur MH-agar non supplémenté (nécessitent des suppléments ou des milieux différents).
Si, juste avant utilisation, un excès d'humidité de surface est présent sur les plaques, placez-les dans un incubateur (35°C) ou une hotte à flux laminaire à température ambiante avec les couvercles entrouverts jusqu'à ce que l'excès d'humidité de surface soit éliminé par évaporation (généralement 10 à 30 minutes ).
Ⅲ. Les
disques d’antibiotiques
🏾 Les disques d’antibiotiques sont fabriqués à partir de papier absorbant de qualité supérieure
imprégnés d’agents antimicrobiens à des concentrations précises. Ils sont clairement
identifiés par un sigle,
comportant
1 à 3 lettres, imprimé de chaque côté du disque
🏾 Les cartouches de disques doivent être conservées dans leur container entre +2 et +8°C
au sec.les disques doivent être amenés à température ambiante. Toute
cartouche ouverte doit être utilisée dans les cinq jours.
Exemples de disques d'antibiotiques abréviations
Sigle |
Antibiotique |
Famille |
Charge du disque (µg) |
AM |
Ampicilline |
Aminopénicilline |
10 |
ATM |
Aztréonam |
Monobactame |
30 |
GM |
Gentamicine |
Aminosides |
10 |
ETP |
Ertapénème |
Carbapénème |
10 |
🏾 Toutes les abréviation de disques d'antibiotiques
🏾 L'antibiotique contenu dans le disque se solubilise dans l'eau de la gélose. Sa diffusion
peut-être schématiquement présentée en deux étapes:
- Une diffusion verticale (en profondeur) dans le milieu contenu dans le cylindre
délimité par le disque pré-imprégné
- Une diffusion horizontale (latéralement) qui répartit l'antibiotique selon un gradient
de concentrations dont le maximum est situé au niveau du disque
Ⅳ. Taille de
l’inoculum '0.5 MF'
La suspension cellulaire doit être préparée dans de l’eau physiologique stérile à partir d’une
culture
jeune et pure sur milieu d’isolement approprié. Dans le cas de Neisseria gonorrhoeae, la
suspension est préparée dans du tampon phosphate stérile à pH 7,2.
Elle doit être ajustée à l'aide d'un photomètre ou par comparaison avec un étalon
d'opacité (échelle de McFarland).En Algérie, l'antibiogramme par diffusion est réalisé
avec
une suspension
calibrée à 0,5
MF ou à une D.O. de 0,08 à 0,10 lue à 625 nm contenant environ 108 bactéries par
ml.Ce nombre est
porté à 109 pour Helicobacter pylori équivalente au standard McFarland
3.
☰ Préparation de l’étalon de turbidité 0,5 McFarland
Comment préparer l’étalon de 0,5 McFarland
1 |
Ajouter 0,5 mL d’une solution à 0,048 mol/L de BaCl 2
(1,175% p/v BaCl 2 ·2H20) à 99,5 mL d’une
solution 0,18 mol/L (0,36 N) de 2
S0 4
(1% v/v) et agiter vigoureusement |
2 |
Vérifier la densité de la suspension à l’aide d’un spectrophotomètre avec un faisceau de 1 cm et
des cuvettes assorties. L’absorbance à 625 nm doit être comprise entre 0,08 et 0,13. |
3 |
Distribuer la suspension dans des tubes de même taille que ceux utilisés pour ajuster
l’inoculum.
Sceller les tubes. |
4 |
Une fois scellés, conserver ces tubes à température ambiante et à l’abri de la lumière. Avant
usage,
mélanger vigoureusement le tube à l’aide d’un Vortex (6 mois de conservation.). |
Ⅴ.
Ensemencement d'antibiogramme
🏾 l’ensemencement doit se faire dans les 15 minutes qui suivent la préparation de
l’inoculum. Il est réalisé par écouvillonnage ou par inondation de telle façon à avoir
après incubation des colonies distinctes mais jointives.
- 1. Plonger l ’écouvillon dans la suspension et éliminer l ’excès de liquide en tournant l ’écouvillon
sur
les parois du tube.
- 2. Frotter la surface entière de la boite d'agar trois fois, en faisant tourner la boite d'environ 60
° C
entre les stries pour assurer une distribution uniforme. Pour minimiser les aérosols, évitez de heurter
les
côtés de la plaque. Enfin, passez un tampon sur le bord de la gélose pour éliminer tout excès
d'humidité.
Ⅵ. Application
des disques
- 1. Appliquer des disques sur la surface d'agar avec un distributeur ou manuellement avec une pince
stérile.
- 2. Appliquer une légère pression avec une pince ou une aiguille stérile pour assurer un contact
complet du
disque avec la gélose (certains distributeurs le font automatiquement).
- 3. Déposer les disques d’antibiotique sur la gélose (maximun 6 disques sur boîte de pétri de 9
cm de dimètre)
- 4. Incubation rapide dans les 15 minutes qui suivent le dépôt des disque (au delà de 30 minutes
les zones d ’inhibition seront faussement agrandies). Incubation 16-24 heures à 35±2°C en
aérobiose (sauf cas cités plus haut sous atmosphère enrichie en Co2 ou micro-aérobiose).
NOTE: Parce qu'une partie du médicament se diffuse presque instantanément, un disque ne
doit
pas être déplacé une fois qu'il a été en contact avec la surface de la gélose. Au lieu de cela, placez un
nouveau disque dans un autre emplacement sur la gélose.
Incubation de l'antibiogramme:
Retourner les boîtes et les incuber idéalement dans les 15 min. qui suivent le dépôt des disques,
sans dépasser 30 min. Si elles sont abandonnées à température ambiante après dépôt des disques,
la pré-diffusion des antibiotiques engendrera des zones d’inhibition faussement agrandies
VII.
Lecture et interpretation de l'antibiogramme:
🏾 Après 16 à 18 heures d'incubation, examinez chaque plaque. Si la plaque a été
striée
de manière satisfaisante et que la concentration d'inoculum est correcte, les zones d'inhibition
résultantes
seront uniformément circulaires et il y aura une pelouse de croissance confluente.
- Si des colonies individuelles sont apparentes, la concentration de l'inoculum
était
trop légère et le test doit être répété.
🏾 Mesurer les diamètres des zones d'inhibition complète (comme
jugé à l'œil nu), y compris le diamètre du disque. Mesurez les zones au millimètre entier le plus proche,
à
l'aide d'étriers coulissants ou d'une règle.
🏾 Comparer le diamètre d'inhibition mesuré (∅ mesuré) et les diamètres critiques d(CCsup) et D(CCinf) selon CLSI "Clinical & Laboratory Standards Institute" ou EUCAST
Mesurer le diamètre de la zone d’inhibition (∅ mesuré) et le comparer aux
diamètres des
concentrations critiques inférieure et supérieure (d(CCsup) et D(CCinf))
∅ mesuré ≥ D(CCinf) |
Sensible (S) |
∅ mesuré < d(CCsup) |
Résistant (R) |
d(CCsup) ≤ ∅ mesuré < D(CCinf) |
Intermédiaire (I) |
Lecture d'antibiogramme