Antibiogramme | Protocole | Interprétation

Ⅰ. Definition et Principe

🏾 L’antibiogramme est un test in vitro de sensibilité d’un germe à un ou plusieurs antibiotiques par la technique de diffusion sur milieux gélosé. Il a pour but de guider le clinicien dans le choix d’un antibiotique pour traiter une infection bactérienne, d’exploitées les données pour la surveillance des résistances bactériennes aux antibiotiques

Principe : Un inoculum standardisé de bactéries (le plus souvent 0.5Mcf) est tamponné sur la surface d'une boite de gélose Mueller-Hinton (MH). Des disques de papier filtre imprégnés d'agents antimicrobiens sont placés sur la gélose. Après une nuit d'incubation, le diamètre de la zone d'inhibition est mesuré autour de chaque disque. En se référant aux tableaux de la norme CLSI ou EUCAST, on obtient un rapport qualitatif de sensible, intermédiaire ou résistant.

Ⅱ. Quel milieu pour antibiogramme ?

🏾 Le milieu de culture doit permettre la croissance de nombreuses bactéries et il ne doit pas contenir d'inhibiteurs des antibiotiques:

• La teneur en calcium et en magnésium doit être contrôlées, car excès de cations bivalents (Ca2+, Mg2+) inhibent l'action des polymyxines.
• Un pH trop acide augmente l'activité des ß-lactamines, un milieu alcalin favorise les aminosides et les macrolides, il doit être compris entre 7,2 et 7,4, valeur qui permet une bonne croissance bactérienne et qui réalise un compromis pour l'activité des antibiotiques.

🏾 Le milieu retenu pour la majorité des espèces bactériennes est celui de Mueller-Hinton (plus 5% de sang pour les germes exigeants):

• Il montre une reproductibilité de lot à lot acceptable pour les tests de sensibilité.
• Il est faible en inhibiteurs qui affectent les résultats des tests de sensibilité au sulfonamide, au triméthoprime et à la tétracycline.
• Il favorise une croissance satisfaisante de la plupart des agents pathogènes.
• Un grand nombre de données et d'expérience ont été collectées sur les tests de sensibilité effectués avec ce milieu.

🏾 Il doit être coulé en boîtes de Petri sur une épaisseur de 4 mm et les géloses doivent être séchées avant l’emploi.

NOTE:

Certaines espèces exigeantes, telles que Haemophilus spp., Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae et viridans et les streptocoques β-hémolytiques ne se développent pas suffisamment sur MH-agar non supplémenté (nécessitent des suppléments ou des milieux différents).

Si, juste avant utilisation, un excès d'humidité de surface est présent sur les plaques, placez-les dans un incubateur (35°C) ou une hotte à flux laminaire à température ambiante avec les couvercles entrouverts jusqu'à ce que l'excès d'humidité de surface soit éliminé par évaporation (généralement 10 à 30 minutes ).

Ⅲ. Les disques d’antibiotiques

🏾 Toutes les abréviation de disques d'antibiotiques

🏾 L'antibiotique contenu dans le disque se solubilise dans l'eau de la gélose. Sa diffusion peut-être schématiquement présentée en deux étapes:

• Une diffusion verticale (en profondeur) dans le milieu contenu dans le cylindre délimité par le disque pré-imprégné
• Une diffusion horizontale (latéralement) qui répartit l'antibiotique selon un gradient de concentrations dont le maximum est situé au niveau du disque

Ⅳ. Taille de l’inoculum '0.5 MF'

La suspension cellulaire doit être préparée dans de l’eau physiologique stérile à partir d’une culture jeune et pure sur milieu d’isolement approprié. Dans le cas de Neisseria gonorrhoeae, la suspension est préparée dans du tampon phosphate stérile à pH 7,2.

Elle doit être ajustée à l'aide d'un photomètre ou par comparaison avec un étalon d'opacité (échelle de McFarland).En Algérie, l'antibiogramme par diffusion est réalisé avec une suspension calibrée à 0,5 MF ou à une D.O. de 0,08 à 0,10 lue à 625 nm contenant environ 10⁸ bactéries par ml.Ce nombre est porté à 10⁹ pour Helicobacter pylori équivalente au standard McFarland 3.

☰ Préparation de l’étalon de turbidité 0,5 McFarland

Ⅴ. Ensemencement d'antibiogramme

🏾 l’ensemencement doit se faire dans les 15 minutes qui suivent la préparation de l’inoculum. Il est réalisé par écouvillonnage ou par inondation de telle façon à avoir après incubation des colonies distinctes mais jointives.

• 1. Plonger l ’écouvillon dans la suspension et éliminer l ’excès de liquide en tournant l ’écouvillon sur les parois du tube.
• 2. Frotter la surface entière de la boite d'agar trois fois, en faisant tourner la boite d'environ 60 ° C entre les stries pour assurer une distribution uniforme. Pour minimiser les aérosols, évitez de heurter les côtés de la plaque. Enfin, passez un tampon sur le bord de la gélose pour éliminer tout excès d'humidité.

Ⅵ. Application des disques

• 1. Appliquer des disques sur la surface d'agar avec un distributeur ou manuellement avec une pince stérile.
• 2. Appliquer une légère pression avec une pince ou une aiguille stérile pour assurer un contact complet du disque avec la gélose (certains distributeurs le font automatiquement).
• 3. Déposer les disques d’antibiotique sur la gélose (maximun 6 disques sur boîte de pétri de 9 cm de dimètre)
• 4. Incubation rapide dans les 15 minutes qui suivent le dépôt des disque (au delà de 30 minutes les zones d ’inhibition seront faussement agrandies). Incubation 16-24 heures à 35±2°C en aérobiose (sauf cas cités plus haut sous atmosphère enrichie en Co2 ou micro-aérobiose).

NOTE: Parce qu'une partie du médicament se diffuse presque instantanément, un disque ne doit pas être déplacé une fois qu'il a été en contact avec la surface de la gélose. Au lieu de cela, placez un nouveau disque dans un autre emplacement sur la gélose.

Incubation de l'antibiogramme:

Retourner les boîtes et les incuber idéalement dans les 15 min. qui suivent le dépôt des disques, sans dépasser 30 min. Si elles sont abandonnées à température ambiante après dépôt des disques, la pré-diffusion des antibiotiques engendrera des zones d’inhibition faussement agrandies

VII. Lecture et interpretation de l'antibiogramme:

🏾 Après 16 à 18 heures d'incubation, examinez chaque plaque. Si la plaque a été striée de manière satisfaisante et que la concentration d'inoculum est correcte, les zones d'inhibition résultantes seront uniformément circulaires et il y aura une pelouse de croissance confluente.

- Si des colonies individuelles sont apparentes, la concentration de l'inoculum était trop légère et le test doit être répété.

🏾 Mesurer les diamètres des zones d'inhibition complète (comme jugé à l'œil nu), y compris le diamètre du disque. Mesurez les zones au millimètre entier le plus proche, à l'aide d'étriers coulissants ou d'une règle.

🏾 Comparer le diamètre d'inhibition mesuré (∅ mesuré) et les diamètres critiques d(CCsup) et D(CCinf) selon CLSI "Clinical & Laboratory Standards Institute" ou EUCAST