- Prenez une lame propre sans graisse et faites un frottis
- Sécher à l’air et fixer l’organisme sur une lame de verre et couvrir d’un carré de papier buvard ou d’essuie-tout coupé pour s’adapter à la lame.
- Saturer le papier buvard avec une solution de teinture vert malachite et le vaporiser à la vapeur pendant 5 minutes, en gardant le papier humide et en ajoutant plus de colorant au besoin. En variante, la lame peut être vaporisée sur un récipient d'eau bouillante.
- Lavez la lame à l'eau du robinet
- Contre-colorer avec 0,5% de safranine pendant 30 secondes . Laver à l'eau du robinet, séchez.
- Examinez la lame au microscope pour la présence d'endospores
☰ Sommaire :
- Ⅰ. Résumé rapide de la technique
- Ⅱ. Que sont les endospores ?
- Ⅲ. Principe de la coloration des endospores
- Ⅳ. Réactifs utilisés
- Ⅴ. Procédure de coloration des endospores
- Ⅵ. Variant :Coloration au vert de malachite à froid
- Ⅶ. Commentaires et conseils #ASM
Ⅰ. Résumé rapide de la technique
☰ Endospores :Les endospores sont vert clair.
☰ Cellules végétatives :Les cellules végétatives sont rouge brunâtre à rose.
☰ Exemples de coloration d'endospore positive : Clostridium perfringens, C. botulinum, C. tetani, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Desulfotomaculum spp, Sporolactobacillus spp, Sporosarcina spp,
Ⅱ. Que sont les endospores ?
Une endospore est une structure résistante produite par certains genres bactériens pathogènes tels que Clostridium afin de survivre dans des conditions environnementales défavorables. Les endospores peuvent résider à l'intérieur de la cellule bactérienne ou peuvent exister sous forme de spores libres
Les bactéries peuvent rester dans cet état suspendu jusqu'à ce que les conditions deviennent favorables et elles peuvent germer et retourner à leur état végétatif.
Ⅲ. Principe de la coloration des endospores
Dans la méthode de Coloration au Vert de Malachite «méthode de Schaeffer-Fulton» , une teinture primaire verte de malachite est forcée dans la spore par vaporisation de l'émulsion bactérienne.Le verte de malachite est soluble dans l'eau et a une faible affinité pour le matériel cellulaire, de sorte que les cellules végétatives peuvent être décolorées avec de l' eau .
La safranine est ensuite appliquée pour contre-colorer les cellules qui ont été décolorées. À la fin du processus de coloration, les cellules végétatives seront roses et les endospores seront vert foncé .
Ⅳ. Réactifs utilisés pour la coloration des endospores
☰ Colorant primaire: vert malachite (solution aqueuse à 0,5% (poids / volume)):
- 0,5 g de vert malachite
- 100 ml d'eau distillée
☰ Agent décolorant:
- Eau du robinet ou eau distillée
☰ Contre-colorant:solution de Safranine (solution alcoolique à 2,5% (poids / volume))
- 2,5 g de safranine O
- 100 ml d'éthanol à 95%
Ⅴ. Procédure de coloration des endospores
Source :#ASM
☰ Endospores :Les endospores sont vert clair.
☰ Cellules végétatives :Les cellules végétatives sont rouge brunâtre à rose.
☰ Exemples de coloration d'endospore positive : Clostridium perfringens, C. botulinum, C. tetani, Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Desulfotomaculum spp, Sporolactobacillus spp, Sporosarcina spp,
Ⅵ. Variant :Coloration au vert de malachite à froid
☰ Pour pour éviter le dégagement de gaz nocifs.
☰ Recouvrir le frottis de vert de malachite pendant au minimum 45 min. Le laver à l'eau, l'essuyer l'aide de papier filtre. Recouvrir ensuite la lame avec une solution de mercurochrome pendant deux minutes. Le laver et le sécher de nouveau. Le frottis est donc prêt à être observé au microscope à l'objectif x100 avec de l'huile à immersion.
Ⅶ. Coloration au vert de Malachite :Commentaires et conseils (#ASM)
- Les grands laboratoires utilisent la microscopie à contraste de phase au lieu de la coloration pour démontrer la présence de spores. L’augmentation de la densité des spores matures les rend très brillantes lors de l’observation au microscope à champ lumineux (difficile à voir)
- Certains laboratoires n’utilisent pas de papier absorbant comme décrit dans la procédure Schaefer-Fulton (il est possible qu’un morceau de papier mal ajusté brûle ou coule)
- Il est utile de savoir qu'il existe de nombreux autres genres qui sont inclus en tant que bactéries formant des endospores : Paenibacillus, Sporolactobacillus, Desulfotomaculum, Thermoanaerobacter, Sporomusa, Sporohalobacter, Anaerobacter, Alicyclobacillus, Amphibacillus, Heliobacterium, Heliophilum, Syntrophospora et Desulfitobacterium. Tous sont en forme de tige.