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◉ Introduction
Le début de la microscopie remonte au début du 17ème siècle, et depuis lors, elle a connu une énorme évolution tant en termes de performance que dans ses domaines d'application.
L'examen microscopique, également connu sous le nom d'examen direct, est un outil indispensable dans un laboratoire d'analyse. Une fois maîtrisée, cette technique permet de fournir rapidement des informations précieuses pour l'orientation diagnostique.
Dans cet article, nous nous limiterons aux utilisations de base du microscope optique en laboratoire d'analyse médicale, y compris la manipulation, les techniques et les différentes applications.
◉ Mise au Point au Microscope Optique
La mise au point au microscope consiste à ajuster la distance entre l'objectif du microscope et l'échantillon pour obtenir l'image la plus nette de ce que vous observez. Voici les étapes générales pour effectuer la mise au point :
- Placez votre échantillon sur la platine du microscope et fixez-le avec les valets. Commencez avec l'objectif à faible grossissement (X 10).
- Utilisez les boutons de commande, généralement des vis de réglage situées sur les côtés du microscope, pour ajuster la hauteur de la platine et amener l'échantillon suffisamment près de l'objectif.
- Regardez à travers l'oculaire et utilisez les vis de réglage macrométrique pour effectuer une première mise au point grossière. Tournez ces vis dans le sens des aiguilles d'une montre pour descendre la platine et dans le sens inverse pour la soulever.
- Une fois que vous avez une image grossière, utilisez les vis de réglage micrométrique pour affiner la mise au point. Ces vis permettent des ajustements plus précis et subtils.
- Si vous avez besoin de changer d'objectif pour obtenir un grossissement plus élevé, faites pivoter la tourelle d'objectifs pour sélectionner l'objectif désiré. Vous devrez peut-être ajuster légèrement la mise au point après avoir changé d'objectif.
- Avec de la pratique régulière et de l'expérience, vous serez en mesure d'utiliser directement un objectif à fort grossissement.
◉ Examen direct à l'état frais
C'est une technique rapide, facile et peu coûteuse qui permet de visualiser l'échantillon sous microscope sans aucune préparation (ni fixation ni coloration).
L'état frais permet de visualiser les différents composants de l'échantillon, mais sa plus grande valeur réside dans sa capacité à conserver les bactéries et les parasites vivants, ce qui permet une observation optimale de leur nombre, de leurs mouvements et de leur agencement.
Elle peut être réalisée directement à partir du produit pathologique (urine, liquide céphalorachidien, etc.) ou à partir d'une suspension bactérienne. Différents supports peuvent être utilisés, tels que les lames et lamelles, les cellules de Malassez et les cellules de Nageotte.
L'observation se fait généralement à l'objectif ×40 avec un diaphragme quasiment fermé pour augmenter le contraste. Il est conseillé d'attendre quelques instants jusqu'à ce que les mouvements liquidiens cessent.
1- L'état frais entre lame et lamelle
L'état frais est une pratique courante, facile, rapide et largement utilisée en laboratoire de bactériologie. Voici les principales étapes :
- Déposer une goutte de votre échantillon sur une lame. Cet échantillon peut être un liquide biologique, une suspension biologique (par exemple urine ou une petite quantité de selles diluées dans de l'eau stérile) ou une suspension bactérienne (quelques colonies bactériennes dissoutes dans de l'eau stérile).
- Recouvrir la goutte avec une lamelle.
- Laisser reposer sur une surface horizontale pendant environ 10 minutes.
- Observer l'échantillon au microscope avec un grossissement de ×40.
Homogénéiser la suspension
Prélever une goutte de la supenssion bactérienne et la déposer sur une lame propre
Poser la lamelle,
Attention! Le liquide ne doit pas déborder.
Selon le type d'échantillon et l'objectif du prélèvement, l'examen à l'état frais permet de détecter la présence ou l'absence de plusieurs composants biologiques tels que :
- Bactéries : pour apprécier leur forme, leur agencement et une éventuelle mobilité.
- Parasites : pour évaluer leur forme, leur mobilité, etc.
- Levures.
- Cellules épithéliales : différents types de cellules telles que rénales, bronchiques, etc.
- Les différentes variantes de globules rouges.
- Globules blancs.
- Les cristaux
- ...etc.
Exemples
Video 01: Fausse mobilité bacterienne
Photo 01: État frais d'urine, observé au microscope avec un grossissement de X40, montrant la présence de nombreuses globules rouges.
2- Cellules Hématimètres
La numération de différents éléments des liquides biologiques est possible en dehors de tout automate grâce à l'utilisation de cellules de verre calibrées appelées hématimètres.
Il s'agit de lames de verre épaisses creusées de rigoles, présentant un quadrillage particulier sur la plate-forme centrale légèrement abaissée. Recouvertes d'une lamelle posée sur les plateformes latérales élevées, elles permettent, avec un volume très précis et connu, de dénombrer les cellules des liquides biologiques.
Il existe plusieurs types d'hémocytomètres, tous dotés de grilles de comptage différentes, parmi les plus utilisés figurent la cellule de Malassez, la cellule de Thoma, la cellule de Nageotte et la cellule Neubauer.
Pour obtenir une numération proche de la réalité, il est important de :
- Ne pas rayer le quadrillage lors du nettoyage de la cellule.
- Bien monter la lamelle sur la cellule
- Déposer la goutte de l'échantillon à numérer correctement, comme décrit ci-dessous
- Bien laisser sédimenter les particules à numérer avant le comptage.
2. 1 Manipulation
- Poser la cellule de comptage sur une surface bien horizontale.
- Coller la lamelle sur la cellule en humectant les deux bords de celle-ci avec un petit chiffon humide propre et essoré.
- Faire glisser la lamelle sur la largeur de la cellule et vérifier la bonne adhésion entre la cellule et la lamelle.
- Homogénéiser le liquide à analyser (ou sa dilution).
- Entre la cellule et la lamelle, laisser rentrer, par capillarité, une goutte de l'échantillon à numérer, grâce à une pipette Pasteur. La goutte ne doit pas déborder dans les rigoles de la cellule et doit recouvrir complètement et d'un seul coup toute la surface quadrillée de la cellule.
- Attendre au moins 5 à 10 minutes, en maintenant la cellule bien à l'horizontale (les éléments cellulaires doivent sédimenter).
➊
➋
➌
➍
Note:
- Si le liquide à analyser est hémorragique, il est recommandé de lyser les hématies avant de compter les autres cellules en diluant le liquide hémorragique de moitié à l'aide d'une solution à 0,5 % d'acide acétique dans l'eau.
- Si le liquide à analyser présente un nombre élevé de cellules, il convient de le diluer dans du sérum physiologique selon les besoins, par exemple à 1/2, 1/5, 1/10 ou plus.
2. 2 Comptage
- Si le comptage est effectué sur du liquide dilué, ne pas oublier de multiplier le nombre d'éléments comptés par le taux de dilution.
◉ Examen microscopique après coloration
La coloration des produits biologiques est une technique très courante en biologie médicale. Elle permet d'apporter plus de détails voire de rendre visibles des éléments qui sont invisibles à l'état frais.
Il existe plusieurs types de colorations, avec différentes procédures de réalisation. Le choix dépend du type de prélèvement et de l'élément recherché. Grossièrement, elles peuvent être classées en colorations simples (non-différentielles) et colorations différentielles
La première étape commune est généralement la réalisation de frottis et de fixation. Ensuite, après coloration, la lecture se fait à un grossissement de X100 avec un diaphragme ouvert.
1- Coloration simple
Les colorations simples, ou coloration directe, sont des procédures rapides à réaliser qui consistent à ajouter un seul colorant au frottis, laisser agir, puis laver, sécher et observer au microscope. Elles permettent de déterminer la présence et la morphologie des éléments biologiques tels que les bactéries, les cellules, etc.
La coloration simple utilise des colorants basiques tels que le bleu de méthylène, la safranine, le violet cristal, le vert malachite, etc.
Photo: Le bleu de méthylène basique colore les noyaux des leucocytes (acides), ce qui permet de différencier entre les lymphocytes et les polynucléaires.
Photo: Lactobacille coloré au bleu de méthylène
2- Coloration différentielles
La coloration différentielle consiste à utiliser plusieurs colorants pour différencier divers types de cellules, de structures et de micro-organismes.
Il existe un certain nombre de méthodes de coloration différentielle, telles que la coloration de Gram, considérée comme la référence en bactériologie, qui permet de différencier les bactéries en Gram positif et Gram négatif. La coloration de Ziehl-Neelsen permet de détecter et de différencier les bacilles tuberculeux des autres bactéries.
Photo: coloration de Gram montrant des cocci Gram positif et des bacilles Gram négatif
Photo: Bacille de Koch coloré par la coloration de Ziehl-Neelsen
Photo: Un PV coloré au Gram, observé au microscope avec un grossissement de X100, montrant la présence de Clue-cells
Photo: Frottis sanguin coloré au MGG, observé au microscope avec un grossissement de X100
◉ Conclusion
En conclusion, l'examen microscopique s'avère être une technique indispensable en laboratoire d'analyse médicale. Il permet une observation détaillée des échantillons biologiques, fournissant ainsi des informations précieuses pour le diagnostic et la prise en charge des patients.
Il est essentiel de souligner l'importance de la rigueur et de la précision dans la réalisation de cet examen, ainsi que la nécessité de prendre en compte les diverses sources d'erreurs potentielles.