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◉ Introduction
L'examen microscopique est un pilier fondamental en bactériologie, permettant l'observation directe et détaillée des bactéries présentes dans divers échantillons biologiques. Utilisé pour la détection, l'identification et l'orientation diagnostique des infections bactériennes, cet outil est indispensable dans les laboratoires de microbiologie médicale.
Depuis l'invention du microscope au 17 ème siècle, la technologie a considérablement évolué, mais l'examen microscopique reste une méthode de base pour examiner la morphologie, la distribution et la dynamique des agents pathogènes.
Cet article traite des techniques de base de l'examen microscopique en bactériologie, y compris les préparations et les colorations spécifiques à la bactériologie.
◉ Mise au Point au Microscope Optique
L'une des premières étapes lors de l'utilisation du microscope est la mise au point. Cela consiste à ajuster la distance entre l'objectif et l'échantillon afin d'obtenir une image nette et claire.
Voici les étapes détaillées pour réaliser la mise au point sur un échantillon :
- Préparation de l'échantillon :
- Placez l'échantillon sur la platine du microscope, fixez-le à l'aide des valets (petites pinces), et assurez-vous que l'échantillon est bien centré sous l'objectif.
- Réglage grossier (avec les vis macrométriques) :
- Commencez avec l'objectif à faible grossissement (X10) pour localiser l'échantillon.
- Utilisez les vis macrométriques pour ajuster la hauteur de la platine et amener l’échantillon plus près de l'objectif.
- Affinement de la mise au point (avec les vis micrométriques) :
- Une fois que l’image devient visible, ajustez finement la mise au point à l’aide des vis micrométriques. Ce réglage permet d’obtenir une image plus nette avec une meilleure précision.
- Changement d'objectif :
- Si vous souhaitez obtenir un grossissement plus élevé, faites pivoter la tourelle pour sélectionner un objectif à plus fort grossissement (X40 ou X100).
- Vous devrez peut-être réajuster légèrement la mise au point après avoir changé d’objectif pour obtenir une image nette à ce nouveau grossissement.
Avec de la pratique régulière et de l'expérience, vous serez en mesure d'utiliser directement un objectif à fort grossissement.
◉ Examen microscopique direct (état frais)
L’examen direct à l’état frais est une technique simple, rapide et peu coûteuse qui permet d’observer des échantillons biologiques sans préparation préalable (ni fixation ni coloration). Cette méthode est particulièrement utile pour observer des bactéries, des parasites et d’autres éléments vivants, qui ne sont visibles que dans leur état naturel.
Le principal avantage de l’examen à l’état frais est la capacité de conserver l’intégrité des organismes vivants, ce qui permet d’observer leur comportement et leur agencement. Cette méthode est souvent utilisée dans les premières étapes du diagnostic, car elle permet d’obtenir des résultats en quelques minutes.
Elle peut être réalisée directement à partir du produit pathologique (urine, liquide céphalorachidien, etc.) ou à partir d'une suspension bactérienne. Différents supports peuvent être utilisés, tels que les lames et lamelles, les cellules de Malassez et les cellules de Nageotte.
L'observation se fait généralement à l'objectif ×40 avec un diaphragme quasiment fermé pour augmenter le contraste. Il est conseillé d'attendre quelques instants jusqu'à ce que les mouvements liquidiens cessent.
1- L'état frais entre lame et lamelle
L’examen microscopique à l’état frais entre lame et lamelle est une pratique courante, facile, rapide et largement utilisée en laboratoire de bactériologie. Voici les principales étapes :
- Déposer une goutte de l’échantillon sur une lame. Cet échantillon peut être :
- Un liquide biologique (ex. : urine, liquide céphalorachidien).
- Une suspension biologique (ex. : petites quantités de selles diluées dans de l'eau stérile).
- Une suspension bactérienne (quelques colonies bactériennes dissoutes dans de l'eau stérile).
- Recouvrir la goutte avec une lamelle.
- Laisser reposer sur une surface horizontale pendant environ 10 minutes.
- Observer l'échantillon au microscope avec un grossissement de ×40.
Homogénéiser la suspension
Prélever une goutte de la supenssion bactérienne et la déposer sur une lame propre
Poser la lamelle,
Attention! Le liquide ne doit pas déborder.
Selon le type d'échantillon et l'objectif de l'analyse, l'examen à l'état frais permet de détecter divers composants biologiques :
- Bactéries : forme, agencement, mobilité.
- Parasites : morphologie, comportement.
- Levures.
- Cellules épithéliales : rénales, bronchiques, etc.
- Globules rouges : variations morphologiques.
- Globules blancs.
- Cristaux.
Exemples
Fausse mobilité bacterienne
État frais d'urine, observé au microscope avec un grossissement de X40, montrant la présence de nombreuses globules rouges.
2- Cellules Hématimètres
La numération des différents éléments dans les liquides biologiques est possible en dehors de tout automate grâce à l'utilisation de cellules de verre calibrées appelées hématimètres. Ces dispositifs permettent de dénombrer précisément les cellules en utilisant un volume contrôlé.
Il existe plusieurs types d'hématimètres, chacun doté d'un quadrillage spécifique.
2. 1 Manipulation
- Poser la cellule de comptage sur une surface bien horizontale.
- Coller la lamelle sur la cellule en humectant les deux bords de celle-ci avec un petit chiffon humide propre et essoré.
- Faire glisser la lamelle sur la largeur de la cellule et vérifier la bonne adhésion entre la cellule et la lamelle.
- Homogénéisez soigneusement le liquide à analyser (ou sa dilution).
- À l'aide d'une pipette Pasteur, introduisez une goutte de l'échantillon entre la cellule et la lamelle par capillarité. Assurez-vous que la goutte recouvre la surface quadrillée sans déborder dans les rigoles.
- Laissez reposer la cellule à l'horizontale pendant 5 à 10 minutes afin de permettre aux particules de sédimenter.
- Procédez au comptage des cellules sous microscope.
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Note:
- Si le liquide à analyser est hémorragique, il est recommandé de lyser les hématies avant de compter les autres cellules en diluant le liquide hémorragique de moitié à l'aide d'une solution à 0,5 % d'acide acétique dans l'eau.
- Si le liquide à analyser présente un nombre élevé de cellules, il convient de le diluer dans du sérum physiologique selon les besoins, par exemple à 1/2, 1/5, 1/10 ou plus.
2. 2 Comptage
- Si le comptage est effectué sur du liquide dilué, ne pas oublier de multiplier le nombre d'éléments comptés par le taux de dilution.
◉ Examen microscopique après coloration
La coloration des échantillons biologiques est une technique incontournable en bactériologie médicale. Elle permet d’obtenir des détails supplémentaires, voire de rendre visibles des éléments microscopiques qui sont souvent invisibles à l’état frais. Ces techniques sont particulièrement essentielles pour identifier des caractéristiques spécifiques des bactéries, orienter les diagnostics et guider les traitements.
Les colorations peuvent être classées en deux grandes catégories : les colorations simples et les colorations différentielles, selon leur objectif et la nature des échantillons à analyser. Avant toute coloration, il est nécessaire de préparer un frottis et de le fixer afin de stabiliser les structures biologiques.
L'observation après coloration s’effectue généralement au grossissement x100, avec un diaphragme ouvert et de l’huile à immersion, afin d’optimiser la visibilité des détails microscopiques.
1- Coloration simple
Les colorations simples, ou coloration directe, consistent à appliquer un seul colorant sur un frottis. Elles sont rapides et permettent d’identifier les contours, les formes, et la taille des cellules ou des bactéries présentes. Parmi les colorants fréquemment utilisés :
- Bleu de méthylène : met en évidence les noyaux cellulaires.
- Safranine : colore les structures acides.
- Violet cristal : utilisé dans certaines colorations différentielles.
- Vert malachite : utile pour visualiser les spores bactériennes.
Photo: Le bleu de méthylène basique colore les noyaux des leucocytes (acides), ce qui permet de différencier entre les lymphocytes et les polynucléaires.
Photo: Lactobacille coloré au bleu de méthylène
2- Coloration différentielles
La coloration différentielle consiste à utiliser plusieurs colorants pour différencier divers types de cellules, de structures et de micro-organismes.
Il existe un certain nombre de méthodes de coloration différentielle, telles que la coloration de Gram, considérée comme la référence en bactériologie, qui permet de différencier les bactéries en Gram positif et Gram négatif. La coloration de Ziehl-Neelsen permet de détecter et de différencier les bacilles tuberculeux des autres bactéries.
Photo: coloration de Gram montrant des cocci Gram positif et des bacilles Gram négatif
Photo: Bacille de Koch coloré par la coloration de Ziehl-Neelsen
Photo: Un PV coloré au Gram, observé au microscope avec un grossissement de X100, montrant la présence de Clue-cells
Photo: Frottis sanguin coloré au MGG, observé au microscope avec un grossissement de X100
◉ Conclusion
En conclusion, l'examen microscopique s'avère être une technique indispensable en laboratoire d'analyse médicale. Il permet une observation détaillée des échantillons biologiques, fournissant ainsi des informations précieuses pour le diagnostic et la prise en charge des patients.
Il est essentiel de souligner l'importance de la rigueur et de la précision dans la réalisation de cet examen, ainsi que la nécessité de prendre en compte les diverses sources d'erreurs potentielles.