» L' examen microscopique presente un outil indispensable au laboratoire d'analyse médicale de façon génerale.

» Le microscope optique a été utilisé depuis le 17ème siècle, lorsque les bases de la biologie cellulaire ont été découvertes. Il donne une image grandie d’un objet en général transparent.

Deux grandes procédures peuvent être utilisées en microbiologie:

• ❖ 1-EXAMEN A L'ÉTAT FRAIS :

-direct sans fixation ni coloration

-observation à l'objectif × 40

• ❖ 2-EXAMEN APRES COLORATION :

- differentes colorations sont réalisées en fonction de l'élément recherché « voir Coloration »

Examen à l'etat frais :

✦ C'est une technique rapide et facile qui permet de voir la bactérie vivante et d'apprécier sa mobilité, sa morphologie et son mode de groupement.

» Il se fait directement à partir du produit pathologique (urine ,LCR,...) ou à partir d'une suspension bactérienne.

❖ Différents supports peuvent être utilisés : lame et lamelle , cellule de MALASSEZ, cellule de NAGEOTTE

1. Lame et lamelle:

❖ La préparation se fait soit à partir d'une supenssion bactérienne après culture, soit à partir du produit pathologique directement ou après centifugation/ dilution (produit très visqueux)

Homogénéiser la suspension

Prélever une goutte de la supenssion bactérienne et la déposer sur une lame propre

Poser la lamelle,
Attention! Le liquide ne doit pas déborder.

❖ L'observation se fait à l'objectif × 40 avec un diaphragme quasiment fermé pour augmenter le contraste. Il est conseillé d'attendre quelques dizaines de secondes jusqu'à disparition des mouvements liquidiens.

✦ Observation de la bacterie:

L'examen à l'état frais permet de:

    • Apprecier la mobilité: une bactérie est dite mobile si elle se déplace dans le champ du microscope avec un mouvement qui lui est propre.

            Mobilité faussement positive:
                 - mouvements browniens
                 - mouvements liquidiens
                 - mouvements pendulaires
            Mobilité faussement négative:
                 - EF à partir d'une culture en milieu solide
                 - température de culture ne permettant pas la mobilité
                 - prélèvement de la culture avec un instrument trop chaud
                 - observation trop tardive

    • Apprecier la morphologie et l'aggencement:

    • Apprécier la présence des leucocytes:

    • Apprécier la présence des hematies:

    • Apprécier la présence des levures:

    • Apprécier la présence des cristaux:

  •Apprécier la présence des cellules épitheliale:

Cellules urothéliales

Cellules rénales

Cellules vaginales

2.cellule MALASSEZ:

❖ Louis-charles Malassez, scientifique français né à Nevers 1842-1909. Malassez est connu pour l'invention de l'hémocytomètre, un outil pour mesurer quantitativement le nombre de cellules sanguines.

❖ Les numérations globulaires de différents liquides biologiques (sang, urine, liquide céphalo rachidien) sont possibles, en dehors de tout automate, grâce à l'utilisation de "cellules" de verres calibrées appelées hématimètres.

❖ Ces lames de verre épaisses creusées de rigoles, présentent un quadrillage particulier sur la plate-forme centrale légèrement abaissée. Recouverte d’une lamelle posée sur les platesformes latérales élevées, un volume très précis et connu permet de dénombrer les cellules des liquides biologiques.

❖ Comment choisir entre la cellule de Malassez, la cellule de Thoma et la cellule de Nageotte ?

    • liquides à forte densité cellulaire (sang) : cellules (ou hématimètres) de Mallassez ou de Thoma.

    • LCR et urine (faible densité cellulaire) : cellule de Nageotte.

    • En fait ce choix n’a pas une importance réelle : il dépend surtout de l’habitude de l’opérateur.

❖ Pour obtenir une numération proche de la réalité, il est important de :

    • ne pas rayer le quadrillage lors du nettoyage de la cellule,

    • bien monter la lamelle sur la cellule,

    • déposer la goutte de l’échantillon à numérer correctement, comme décrit ci-dessous,

    • bien laisser sédimenter les particules à numérer avant le comptage.

✦ Principe:

❖ On dépose, entre cellule et lamelle, une goutte de l’échantillon, dilué ou non, puis on compte dans le quadrillage (volume précis) les éléments voulus.

❖ On ramène le résultat obtenu en éléments par litre de liquide.

    •Le quadrillage total a un volume de 1 µl. 
    •Dimensions : L : 2,5 mm, l : 2 mm, H (ou profondeur) : 0,20 mm.
    •Constitué de 100 rectangles d’égales surfaces.

A. Si le liquide à analyser est hémorragique

-Avant de compter les cellules autres qu’hématies il est préférable de lyser les hématies en diluant au 1/2 le liquide hémorragique à l’aide d’une solution à 0,5% d’acide acétique dans l’eau.

-Ne pas oublier de multiplier par 2 (facteur de dilution dû à la solution d’acide acétique) le résultat du comptage.

B. Si on prévoit un nombre élevé de cellules

-Diluer le liquide à analyser : à 1/2 ou 1/5 ou 1/10 ou plus, dans du sérum physiologique.

-Ne pas oublier de multiplier le résultat du comptage par la dilution.

C. Avant de charger la cellule :

• placer une lamelle sur la cellule : pour la cellule de Malassez : lamelle plane,

• poser la cellule sur une surface bien horizontale,

• "coller" la lamelle sur la cellule, en humectant les deux bords de celui-ci avec un petit chiffon humide propre et essoré,

• faire glisser la lamelle sur la largeur de la cellule et vérifier la bonne adhésion " cellule - lamelle".

➊

➋

➌

➍

D. Introduire le liquide à analyser dans la cellule :

• homogénéiser le liquide à analyser (ou sa dilution),

• entre cellule et lamelle, laisser rentrer, par capillarité, une goutte de l’échantillon à numérer, grâce à une pipette Pasteur. La goutte ne doit pas déborder dans les rigoles de la cellule et la goutte doit recouvrir complètement et d’un seul coup toute la surface quadrillée de la cellule.

❖ Attendre au moins 5 - 10 minutes, la cellule bien à l’horizontal, en chambre humide (par exemple une boite de Pétri avec un papier plié et humide au fond), avant d’entreprendre le comptage (les éléments cellulaires doivent sédimenter).

✦ Compter les éléments cellulaires:

❖ Avant de faire le comptage :

    • faire une observation à l’objectif x10 non seulement pour repérer le quadrillage mais aussi pour vérifier que les cellules à compter sont réparties de façon homogène ; si l’homogénéité est jugée insuffisante il faut tout recommencer, c’est-à-dire charger un nouvel hématimètre à partir de la suspension réhomogénéisée ;

    • passer à l’objectif x40 pour effectuer le comptage

❖ Pour les éléments chevauchent les lignes, comptez tous ceux qui chevauchent les lignes à gauches et en haut. Ne comptez aucun élément qui chevauche les lignes à droite et en bas.

❖ Le quadrillage est donc constitué de 10 bandes verticales de 0,25 mm de large et de 10 bandes horizontales de 0,20 mm de large formant ainsi 100 rectangles, on ne comptera les cellules que dans 10 des 25 rectangles non contigus pris au hasard dans la cellule.

❖On fait ensuite la somme des cellules observées dans chaque rectangle, on divise ce nombre par 10 (nombre de rectangles comptés), on obtient ainsi le nombre de cellules par rectangle, il suffit de multiplier le nombre obtenu par 100 pour connaître le nombre d'entités cellulaires par mm3

Pratique:la moyenne de 4 à 5 rectangle et on la multiplie par 100

Exemple de comptage :

2.cellule NAGEOTTE:

❖ Jean Nageotte, Né à Dijon 1866-1948. Il fut médecin de la Salpêtrière et professeur au collège de France. En 1902, il fait des essais de numération du liquide céphalo-rachidien et envisage la nécessité d'employer un hématimètre pouvant contenir 100 mm3 au moins de liquide.

        -Le quadrillage total constitué de : 40 bandes (Chaque bande a un volume de 1,25
        microlitre)
        -Dimensions d'une bande : L : 10 mm,l : 0,25 mm, H (ou profondeur) : 0,50 mm

Manipulations:

Identique au cellule malassez

le comptage :

       - Soit n le nombre d'éléments comptés (hématies ou leucocytes)
       - N le nombre d'éléments par microlitre (µl)
       - V le volume de comptage :V = 5 µl (4 bandes de 1,25 µl)
       * N = n / V

Pratique :le nombre d éléments dans 4 bandes (5mm)le nombre totale est divise par 5(nbre /mm ) ou la moyenne de 3 multipliée par 0,8

Si comptage effectué sur du liquide dilué : ne pas oublier de multiplier le nombre d'éléments comptés doit être multiplié par le taux de dilution.