Ⅰ. Définition
La coloration de Gram est la coloration différentielle microbiologique la plus
importante et la plus largement utilisée, publiée par Hans Christian Gram en 1884, elle permet de différencier
les bactéries selon 2 critères principaux : leur forme et leur affinité pour les colorants :
- Forme : Paires, Tétrades, Groupes, Chaînes, Lancettes...
-
Affinité pour les colorants : Gram positif ou Gram négatif
Ⅱ. Principe de la coloration de Gram
Qu'est-ce qui fait que certaines bactéries retiennent le violet gentiane (Gram positif) tandis que d'autres libèrent facilement le colorant lorsqu'on ajoute de l'alcool (Gram négatif) ?
Les parois des bactéries à
Gram négatif ont un taux élevé de lipides (à cause de la membrane externe)
et
une fine couche de peptidoglycane. L'alcool contenu dans le décolorant extrait le lipide, ce
qui
rend la paroi des bactéries à Gram négatif plus poreuse, et incapable de
retenir le complexe
violet-lugol, décolorant ainsi la bactérie. Le peptidoglycane plus épais et le degré de
réticulation plus élevé piège le complexe violet-lugol plus efficacement, ce qui rend la
paroi
Gram positif moins sensible à la décoloration.
De plus, la coloration Gram-positive et Gram-négative des bactéries révèle la morphologie globale des bactéries, de sorte que les bactéries peuvent également être étiquetées en tant que bacilles ou cocci.
Ⅲ. Composition et préparation des
colorants
Globalement :
- Violet de gentiane phéniqué :
• violet de gentiane : ..........10 g
• phénol : ......................20 g
• éthanol (95 °GL) :.......... 100 ml
• eau distillée : ...............01 l
- Solution iodée de Gram ou lugol : iodure de potassium : 20 g ; iode
métalloïde
I2 : 10 g ; eau 1 l ;
- Solution de safranine : safranine O :25 g ; éthanol à 95 °GL : 100 ml ;
solution
aqueuse d’oxalate d’ammonium à 25 g/l : 800 ml ;
- ou fuchsine pour Gram : fuchsine de Ziehl = fuchsine basique : 10 g ;
phénol :
50
g ; éthanol : 100 ml ; eau distillée : 1 l. Diluer au 1/10° pour la fuchsine pour GRAM ;
- Décolorant alcool acétone : éthanol (alcool) "absolu" 5 volumes ; acétone
: 1
volume ;
Conservation :
- En flacon hermétique, à l’abri de la lumière, de préférence au frais : plus de 3
ans sauf pour la fuchsine diluée.
- Attention : filtrer lorsque l’on rempli les flacons pour l’utilisation quotidienne
à partir des flacon de réserve.
Ⅳ. Les étapes
• Quelle que soit le colorant utilisé la technique reste
sensiblement la même comme suite:
❶ Inonder le frottis séché à l'air et fixé à la chaleur pendant 1 minute
avec le
réactif
de
coloration au cristal violet. Veuillez noter que la qualité du frottis (concentration
cellulaire trop lourde ou trop légère) affectera les résultats de la coloration.
❷ Laver la lame dans un jet doux et indirect d'eau du robinet pendant 2 secondes
❸ Inondation avec le mordant : iode ou lugol. Attendez 1 minute
❹ Laver la lame dans un jet doux et indirect d'eau du robinet pendant 2 secondes.
❺ Inondation la lame avec agent décolorant. Attendre 15 secondes ou ajouter goutte
à
goutte
pour faire sortir l’agent de décoloration
❻ Inondation la lame avec contre-colorant,'safranine'. Patienter 30 secondes à 1
minute.
❼ Laver la lame dans un jet d'eau douce et indirecte de l'eau du robinet jusqu'à
ce
qu'aucune couleur n'apparaisse dans l'effluent, puis sécher avec du papier absorbant.
❽ Observez les résultats de la procédure de coloration sous immersion dans
l'huile.Examiner
au microscope, objectif x100
À la fin ,
les
bactéries à
GRAM négatif tacheront le rose / rouge et les bactéries à Gram
positif tacheront le bleu / violet.
- Il faut cependant savoir que la coloration de Gram peut être variable
pour
une
même espèce (par
exemple, le pneumocoque se décolore facilement, de même, certaines bactéries
Gram
positif
quand les colonies sont âgées).
- Certaines bactéries sont même dites « Gram faible » ou « Gram variable » (ex:
corynébactéries).
☰ Risques d’erreurs
- Attention, une mauvaise coloration peut conduire à des erreurs d’identification
bactérienne ou à une mauvaise orientation de diagnostic.
Faux positif
- étalement trop épais (mauvaise décoloration des bactéries en profondeur),
- dépôt de colorant dans le flacon de violet de gentiane : filtrer le colorant pour
y remédier
- solution iodée mal égouttée,
- décolorant laissé trop peu de temps,
- utilisation de la fuchsine avec certains germes : les Neisseria et les
Acinetobacter , en particulier, sont "avides" en fuchsine et la concentrent
jusqu’à
un
rouge sombre difficile à distinguer du violet.
Faux négatif
- dans toute population de Gram + on voit des Gram
-
(parfois très nombreux) : ce
sont des cadavres de bactéries Gram +,
- colorants de mauvaise qualité ou trop dilués,
- solution de lugol laissée trop peu de temps,
- décolorant laissé trop longtemps ou mal rincé.
Ⅴ. Contrôle de qualité
- Etalez une mince couche de selles sur une lame et colorez là. Il doit apparaître
de nombreuses bactéries Gram positif et négatif.
☰ Remarque : Il est recommandé de
réaliser, avec la
même préparation de selles diluées, une ou plusieurs dizaines de lames que l’on sèche,
que l’on fixe et qu’on emballe séparément avec du papier aluminium . On les conserve à
+4°C. Cela permet d’éliminer le paramètre : épaisseur du frottis et de se concentrer sur
la qualité des réactifs et sur les temps de coloration et de décoloration.
- L'épaisseur du frottis utilisé affectera le
résultat de la coloration. L'étape la plus cruciale pour obtenir le résultat de la
coloration est l'étape de décoloration.
- Une décoloration excessive entraînera un résultat erroné où les frottis Gram
positives peuvent apparaître rose ou rouge indiquant un résultat
Gram
négatif,
et une décoloration insuffisante conduira à un résultat erroné où les frottis
Gram
négatives
peuvent apparaître de bleu à violet indiquant un Gram positif.
- Le degré de décoloration requis est déterminé par l'épaisseur du frottis
- Le groupe ( #ASM ) recommande que les
cellules
soient préparées avec un frottis mince sans zones d'agglutination ou d'incohérence. Lors
de
la coloration du frottis mince, un court temps de décoloration doit être utilisé.
- Certaines personnes inondent la diapositive pendant 15 secondes ou moins avec un agent
décolorant, tandis que d'autres recommandent d'ajouter l'agent décolorant goutte à
goutte
pendant 5 à 15 secondes ou jusqu'à ce que la couleur de l'agent décolorant qui s'écoule
de
la diapositive ne montre plus aucune couleur.
- Il est recommandé d'utiliser de jeunes cultures en croissance active . Une paroi cellulaire intacte est requise pour une
précise. Les cultures plus anciennes peuvent avoir des
cassures dans la
paroi cellulaire et donnent souvent des résultats à Gram variable où un
mélange de cellules
- Lors de la visualisation des diapositives, utilisez la microscopie à fond clair et
ajustez
suffisamment la luminosité pour révéler la couleur de l'échantillon.
- Le test de l'hydroxyde de potassium 'KOH' peut être utilisé comme test de
confirmation pour la coloration de Gram La formation d'une
chaîne
(ADN) dans 3% de KOH indique que l'isolat est un organisme Gram
négatif ( Les parois
cellulaires à Gram négatif sont décomposées par 3% de KOH et
libèrent à leur tour un
matériau chromosomique viscoïde qui fait que la suspension devient épaisse et
filandreuse.)
- 1- une goutte de 3% KOH sur une lame microscopique.
- 2- transférer une quantité généreuse de bactéries (cultivées pendant 24-48 h) à
la goutte de KOH
Remuer soigneusement
- 3-La solution de bactéries à Gram négatif sera visqueuse et
formera une chaîne
mucoïde dans les 30 secondes
Ⅶ. Les bactéries Gram positif et les bactéries Gram
négatif
liste des bactéries Gram positif et les bactéries Gram négatif
| Description du Morphotype |
Organismes les plus courants |
| Cocci à Gram positif |
| Paires |
Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus spp. |
| Tétrades |
Micrococcus, Staphylococcus, Peptostreptococcus spp |
| Groupes |
Staphylococcus, Peptostreptococcus, Stomatococcus spp. |
| Chaînes |
Streptococcus, Peptostreptococcus spp. |
| Clusters, intracellulaires |
Streptococcus spp. Microaérophile, streptocoques viridans, Staphylococcus
spp.
|
| Encapsulé |
Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes (rarement), Stomatococcus
mucilaginosus |
| En forme d'ancet |
Streptococcus pneumoniae |
| Cocci à Gram negatif |
| |
Neisseria spp., Moraxella catarrhalis. |
| Bacilles à Gram positif |
| Petit |
Listeria monocytogenes, Corynebacterium spp. |
| Moyen |
Lactobacillus, bacilles anaérobies |
| Grand |
Clostridium, Bacillus spp. |
| Diphtéroïde |
Corynebacterium, Propionibacterium, Rothia spp. |
| Pléomorphe, Gram variables |
Gardnerella vaginalis |
| Perlé |
Mycobactéries, lactobacilles affectés par les antibiotiques et
corynébactéries |
| Filamenteux |
Morphotypes anaérobies, cellules affectées par les antibiotiques |
| Filamenteux, perlé, ramifié |
Actinomycetes, Nocardia, Nocardiopsis, Streptomyces, Rothia spp. |
| Formes bifides ou en V |
Bifidobacterium spp., brevibacteria |
| Coccobacilles à Gram négatif |
Bordetella, Haemophilus spp. (pléomorphe) |
| Masses |
Veillonella spp. |
| Chaînes |
Prevotella, Veillonella spp |
| Bacilles à Gram négatif |
| Petit |
Haemophilus, Legionella (thin with filaments), Actinobacillus, Bordetella,
Brucella, Francisella,
Pasteurella, Capnocytophaga, Prevotella, Eikenella spp. |
| Bipolaire |
Klebsiella pneumoniae, Pasteurella spp., Bacteroides spp. |
| Moyen |
Entériques, pseudomonas |
| Grand |
Clostridia ou bacilles dévitalisés |
| Incurvée |
Vibro, Campylobacter spp. |
| Spirale |
Campylobacter, Helicobacter, Gastrobacillum, Borrelia, Leptospira,
Treponema spp |
| Fusiforme |
Fusobacterium nucleatum |
| Filaments |
Fusobacterium necrophorum (pléomorphe) |
🏾 Questions fréquemment posées
Q : Qui est l'auteur de la coloration Gram ?
R : La coloration de Gram doit son nom au bactériologiste danois Hans Christian Gram (1853 – 1938) qui mis au point le protocole de la coloration en 1884.
Q : Quelles sont les 4 étapes de la coloration de Gram ?
R : La coloration de Gram consiste à colorer les bactéries, à fixer la couleur avec un mordant, à décolorer les bactéries et à appliquer une contre-coloration.
Pour certains auteurs, ils considèrent qu'il y a 5 étapes de coloration de Gram dont la première est la réalisation d'un frottis de bactéries sur une lame, puis la coloration des bactéries, la fixation, la décoloration et enfin la contre-coloration.
Q : Quels sont les 2 types de coloration de Gram ?
R : Deux grands groupes : gram-positif et gram-négatif
Q : Pourquoi Dit-on que la coloration de Gram est une coloration différentielle ?
R :Elle est dite une coloration différentielle parce qu’elle permet de différencier les bactéries selon 2 critères principaux : leur forme (paires, tétrades, groupes, chaînes...) et leur affinité pour les colorants (: gram-positif et gram-négatif).
Q : De quelle couleur est gram négatif ?
R : Les organismes gram-négatifs sont de couleur rose - rouge.
Q : De quelle couleur est gram positif ?
R : Les organismes Gram-positifs sont de couleur violette ou bleue
Q : Pourquoi l'iode est-il utilisé dans la coloration de Gram ?
R :L'iode est ajouté comme mordant pour la fixation du colorant, il former le complexe cristal violet-iode afin que le colorant ne puisse pas être éliminé.
Q : Pourquoi l'alcool est-il utilisé dans la coloration de Gram ?
R : Les parois cellulaires à Gram négatif contiennent une forte concentration de lipides solubles dans l'alcool. Le décolorant dissout les lipides, augmentant la perméabilité de la paroi cellulaire et permettant au complexe cristal violet-iode de s'écouler hors de la cellule.
