Coloration de Gram | Principe | Procedure | Interprétation | Astuces

🏾 Contenu :

Ⅰ. Définition

La coloration de Gram est la coloration différentielle microbiologique la plus importante et la plus largement utilisée, publiée par Hans Christian Gram en 1884, elle permet de différencier les bactéries selon 2 critères principaux : leur forme et leur affinité pour les colorants :

  • Forme : Paires, Tétrades, Groupes, Chaînes, Lancettes...
  • Affinité pour les colorants : Gram positif ou Gram négatif

Coloration-Gram


Ⅱ. Principe de la coloration de Gram

Qu'est-ce qui fait que certaines bactéries retiennent le violet gentiane (Gram positif) tandis que d'autres libèrent facilement le colorant lorsqu'on ajoute de l'alcool (Gram négatif) ?

Les parois des bactéries à Gram négatif ont un taux élevé de lipides (à cause de la membrane externe) et une fine couche de peptidoglycane. L'alcool contenu dans le décolorant extrait le lipide, ce qui rend la paroi des bactéries à Gram négatif plus poreuse, et incapable de retenir le complexe violet-lugol, décolorant ainsi la bactérie. Le peptidoglycane plus épais et le degré de réticulation plus élevé piège le complexe violet-lugol plus efficacement, ce qui rend la paroi Gram positif moins sensible à la décoloration.

De plus, la coloration Gram-positive et Gram-négative des bactéries révèle la morphologie globale des bactéries, de sorte que les bactéries peuvent également être étiquetées en tant que bacilles ou cocci.


Ⅲ. Composition et préparation des colorants

Globalement :

- Violet de gentiane phéniqué :

            • violet de gentiane : ..........10 g 
            • phénol : ......................20 g 
            • éthanol (95 °GL) :.......... 100 ml 
            • eau distillée : ...............01 l

- Solution iodée de Gram ou lugol : iodure de potassium : 20 g ; iode métalloïde I2 : 10 g ; eau 1 l ;

- Solution de safranine : safranine O :25 g ; éthanol à 95 °GL : 100 ml ; solution aqueuse d’oxalate d’ammonium à 25 g/l : 800 ml ;

- ou fuchsine pour Gram : fuchsine de Ziehl = fuchsine basique : 10 g ; phénol : 50 g ; éthanol : 100 ml ; eau distillée : 1 l. Diluer au 1/10° pour la fuchsine pour GRAM ;

- Décolorant alcool acétone : éthanol (alcool) "absolu" 5 volumes ; acétone : 1 volume ;

Conservation :

- En flacon hermétique, à l’abri de la lumière, de préférence au frais : plus de 3 ans sauf pour la fuchsine diluée.

- Attention : filtrer lorsque l’on rempli les flacons pour l’utilisation quotidienne à partir des flacon de réserve.



Ⅳ. Les étapes

• Quelle que soit le colorant utilisé la technique reste sensiblement la même comme suite:

❶ Inonder le frottis séché à l'air et fixé à la chaleur pendant 1 minute avec le réactif de coloration au cristal violet. Veuillez noter que la qualité du frottis (concentration cellulaire trop lourde ou trop légère) affectera les résultats de la coloration.

❷ Laver la lame dans un jet doux et indirect d'eau du robinet pendant 2 secondes

❸ Inondation avec le mordant : iode ou lugol. Attendez 1 minute

❹ Laver la lame dans un jet doux et indirect d'eau du robinet pendant 2 secondes.

❺ Inondation la lame avec agent décolorant. Attendre 15 secondes ou ajouter goutte à goutte pour faire sortir l’agent de décoloration

❻ Inondation la lame avec contre-colorant,'safranine'. Patienter 30 secondes à 1 minute.

❼ Laver la lame dans un jet d'eau douce et indirecte de l'eau du robinet jusqu'à ce qu'aucune couleur n'apparaisse dans l'effluent, puis sécher avec du papier absorbant.

❽ Observez les résultats de la procédure de coloration sous immersion dans l'huile.Examiner au microscope, objectif x100


À la fin , les bactéries à GRAM négatif tacheront le rose / rouge et les bactéries à Gram positif tacheront le bleu / violet.

coloration de GRAM

- Il faut cependant savoir que la coloration de Gram peut être variable pour une même espèce (par exemple, le pneumocoque se décolore facilement, de même, certaines bactéries Gram positif quand les colonies sont âgées).

- Certaines bactéries sont même dites « Gram faible » ou « Gram variable » (ex: corynébactéries).

☰ Risques d’erreurs


- Attention, une mauvaise coloration peut conduire à des erreurs d’identification bactérienne ou à une mauvaise orientation de diagnostic.

Ⅴ. Contrôle de qualité

- Etalez une mince couche de selles sur une lame et colorez là. Il doit apparaître de nombreuses bactéries Gram positif et négatif.

☰ Remarque : Il est recommandé de réaliser, avec la même préparation de selles diluées, une ou plusieurs dizaines de lames que l’on sèche, que l’on fixe et qu’on emballe séparément avec du papier aluminium . On les conserve à +4°C. Cela permet d’éliminer le paramètre : épaisseur du frottis et de se concentrer sur la qualité des réactifs et sur les temps de coloration et de décoloration.



Ⅵ. Comentaires et Astuces (#ASM )

- L'épaisseur du frottis utilisé affectera le résultat de la coloration. L'étape la plus cruciale pour obtenir le résultat de la coloration est l'étape de décoloration.

- Une décoloration excessive entraînera un résultat erroné où les frottis Gram positives peuvent apparaître rose ou rouge indiquant un résultat Gram négatif, et une décoloration insuffisante conduira à un résultat erroné où les frottis Gram négatives peuvent apparaître de bleu à violet indiquant un Gram positif.

- Le degré de décoloration requis est déterminé par l'épaisseur du frottis

- Le groupe ( #ASM ) recommande que les cellules soient préparées avec un frottis mince sans zones d'agglutination ou d'incohérence. Lors de la coloration du frottis mince, un court temps de décoloration doit être utilisé.

- Certaines personnes inondent la diapositive pendant 15 secondes ou moins avec un agent décolorant, tandis que d'autres recommandent d'ajouter l'agent décolorant goutte à goutte pendant 5 à 15 secondes ou jusqu'à ce que la couleur de l'agent décolorant qui s'écoule de la diapositive ne montre plus aucune couleur.

- Il est recommandé d'utiliser de jeunes cultures en croissance active . Une paroi cellulaire intacte est requise pour une précise. Les cultures plus anciennes peuvent avoir des cassures dans la paroi cellulaire et donnent souvent des résultats à Gram variable où un mélange de cellules

- Lors de la visualisation des diapositives, utilisez la microscopie à fond clair et ajustez suffisamment la luminosité pour révéler la couleur de l'échantillon.

Ⅶ. Les bactéries Gram positif et les bactéries Gram négatif

liste des bactéries Gram positif et les bactéries Gram négatif
Description du Morphotype Organismes les plus courants
Cocci à Gram positif
Paires Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus spp.
Tétrades Micrococcus, Staphylococcus, Peptostreptococcus spp
Groupes Staphylococcus, Peptostreptococcus, Stomatococcus spp.
Chaînes Streptococcus, Peptostreptococcus spp.
Clusters, intracellulaires Streptococcus spp. Microaérophile, streptocoques viridans, Staphylococcus spp.
Encapsulé Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes (rarement), Stomatococcus mucilaginosus
En forme d'ancet Streptococcus pneumoniae
Cocci à Gram negatif
Neisseria spp., Moraxella catarrhalis.
Bacilles à Gram positif
Petit Listeria monocytogenes, Corynebacterium spp.
Moyen Lactobacillus, bacilles anaérobies
Grand Clostridium, Bacillus spp.
Diphtéroïde Corynebacterium, Propionibacterium, Rothia spp.
Pléomorphe, Gram variables Gardnerella vaginalis
Perlé Mycobactéries, lactobacilles affectés par les antibiotiques et corynébactéries
Filamenteux Morphotypes anaérobies, cellules affectées par les antibiotiques
Filamenteux, perlé, ramifié Actinomycetes, Nocardia, Nocardiopsis, Streptomyces, Rothia spp.
Formes bifides ou en V Bifidobacterium spp., brevibacteria
Coccobacilles à Gram négatif Bordetella, Haemophilus spp. (pléomorphe)
Masses Veillonella spp.
Chaînes Prevotella, Veillonella spp
Bacilles à Gram négatif
Petit Haemophilus, Legionella (thin with filaments), Actinobacillus, Bordetella, Brucella, Francisella, Pasteurella, Capnocytophaga, Prevotella, Eikenella spp.
Bipolaire Klebsiella pneumoniae, Pasteurella spp., Bacteroides spp.
Moyen Entériques, pseudomonas
Grand Clostridia ou bacilles dévitalisés
Incurvée Vibro, Campylobacter spp.
Spirale Campylobacter, Helicobacter, Gastrobacillum, Borrelia, Leptospira, Treponema spp
Fusiforme Fusobacterium nucleatum
Filaments Fusobacterium necrophorum (pléomorphe)




Reference

  1. Gram staining
  2. Differential staining of bacteria: gram stain
  3. ASM - Gram Stain Protocols
  4. Jay Hardy - Gram’s Serendipitous Stain
  5. Nishant Tripathi; Amit Sapra - https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK562156/
  6. Andreia Popescu - The Gram Stain after More than a Century
  7. Clinical Microbiology Procedures Handbook 4ed
  8. TEXtBOOK Diagnostic Microbiology 4ed
  9. T J Beveridge - Mechanism of gram variability in select bacteria