Ⅱ -1) Microscopie optique à fond clair
- Le microscope optique à fond clair forme une image foncée sur un fond brillant.
- Dans un microscope à fond clair, la lumière (miroir ou lumière électrique) est concentrée sur le plan de l'échantillon par un condenseur situé sous la platine. L'objectif grossit l'objet en formant une image primaire réelle agrandie. Celle-ci est à son tour grossie par l'oculaire. Le grossissement total est égal à celui de l'oculaire multiplié par celui de l'objectif.
Ainsi, avec un objectif x40 et un oculaire x10, le grossissement total sera de 400 fois.
L'examen microscopique en bactériologie peut être effectué sans coloration de l'échantillon par observation directe entre lame et lamelle, ou bien après coloration
L’examen à l’état frais
- Les méthodes fondées sur la technique de l'état frais correspondent à l'observation d'un matériel biologique ou d'une suspension bactérienne entre lame et lamelle sans fixation préalable.
Etude qualitative
L’examen des micro-organismes à l’état frais est utile pour :
- Observer les activités cellulaires telles que la mobilité et la fission binaire.
- Observez les tailles et les formes naturelles des cellules,
Etude quantitative
-Elle permet de répondre en nombre d'éléments figurés présents dans les prélèvements liquides par unité de volume (millimètre cube ou microlitre, millilitre).
- On utilise dans ce but les hématimètres communément appelés cellules.
- Ces lames de verre épaisses creusées de rigoles, présentent un quadrillage particulier sur la plate-forme centrale légèrement abaissée. Recouverte d’une lamelle posée sur les platesformes latérales élevées, un volume très précis et connu permet de dénombrer les cellules des liquides biologiques.
- Comment choisir entre la cellule de Malassez, la cellule de Thoma et la cellule de Nageotte ?
- - liquides à forte densité cellulaire (sang) : cellules (ou hématimètres) de Mallassez ou de Thoma.
- - LCR et urine (faible densité cellulaire) : cellule de Nageotte.
- - En fait ce choix n’a pas une importance réelle : il dépend surtout de l’habitude de l’opérateur.
A. Si le liquide à analyser est hémorragique
-Avant de compter les cellules autres qu’hématies il est préférable de lyser les hématies en diluant au 1/2 le liquide hémorragique à l’aide d’une solution à 0,5% d’acide acétique dans l’eau.
-Ne pas oublier de multiplier par 2 (facteur de dilution dû à la solution d’acide acétique) le résultat du comptage.
B. Si on prévoit un nombre élevé de cellules
-Diluer le liquide à analyser : à 1/2 ou 1/5 ou 1/10 ou plus, dans du sérum physiologique.
-Ne pas oublier de multiplier le résultat du comptage par la dilution.
C. Avant de charger la cellule :
- Placer une lamelle sur la cellule : pour la cellule de Malassez : lamelle plane,
- Poser la cellule sur une surface bien horizontale,
- "Coller" la lamelle sur la cellule, en humectant les deux bords de celui-ci avec un petit chiffon humide propre et essoré,
- Faire glisser la lamelle sur la largeur de la cellule et vérifier la bonne adhésion " cellule - lamelle".
D. Introduire le liquide à analyser dans la cellule :
- Homogénéiser le liquide à analyser (ou sa dilution),
- Entre cellule et lamelle, laisser rentrer, par capillarité, une goutte de l’échantillon à numérer, grâce à une pipette Pasteur. La goutte ne doit pas déborder dans les rigoles de la cellule et la goutte doit recouvrir complètement et d’un seul coup toute la surface quadrillée de la cellule.
Attendre au moins 5 - 10 minutes, la cellule bien à l’horizontal,
en chambre humide (par exemple une boite de Pétri avec un papier plié et humide au fond),
avant d’entreprendre le comptage (les éléments cellulaires doivent sédimenter).
La cellule de Mallassez
Louis-charles Malassez, scientifique français né à Nevers 1842-1909. Malassez est connu pour l'invention de l'hémocytomètre, un outil pour mesurer quantitativement le nombre de cellules sanguines.
•Le quadrillage total a un volume de 1 µl.
•Dimensions : L : 2,5 mm, l : 2 mm, H (ou profondeur) : 0,20 mm.
•Constitué de 100 rectangles d’égales surfaces.
☰ Avant de faire le comptage :
- - Faire une observation à l’objectif x10 non seulement pour repérer le quadrillage mais aussi pour vérifier que les cellules à compter sont réparties de façon homogène ; si l’homogénéité est jugée insuffisante il faut tout recommencer, c’est-à-dire charger un nouvel hématimètre à partir de la suspension ré-homogénéisée
- - Passer à l’objectif x40 pour effectuer le comptage
☰ Pour les éléments chevauchent les lignes, comptez tous ceux qui chevauchent les lignes à gauches et en haut. Ne comptez aucun élément qui chevauche les lignes à droite et en bas.
☰ Le quadrillage est donc constitué de 10 bandes verticales de 0,25 mm de large et de 10 bandes horizontales de 0,20 mm de large formant ainsi 100 rectangles, on ne comptera les cellules que dans 10 des 25 rectangles non contigus pris au hasard dans la cellule.
☰ On fait ensuite la somme des cellules observées dans chaque rectangle, on divise ce nombre par 10 (nombre de rectangles comptés), on obtient ainsi le nombre de cellules par rectangle, il suffit de multiplier le nombre obtenu par 100 pour connaître le nombre d'entités cellulaires par mm3
Astuce:la moyenne de 4 à 5 rectangle et on la multiplie par 100
Exemple de comptage :
La cellule de Nageotte
- Jean Nageotte, Né à Dijon 1866-1948. Il fut médecin de la Salpêtrière et professeur au collège de France. En 1902, il fait des essais de numération du liquide céphalo-rachidien et envisage la nécessité d'employer un hématimètre pouvant contenir 100 mm3 au moins de liquide.
-Le quadrillage total constitué de : 40 bandes (Chaque bande a un volume de 1,25
microlitre)
-Dimensions d'une bande : L : 10 mm,l : 0,25 mm, H (ou profondeur) : 0,50 mm
☰ le comptage :
- Soit n le nombre d'éléments comptés (hématies ou leucocytes)
- N le nombre d'éléments par microlitre (µl)
- V le volume de comptage :V = 5 µl (4 bandes de 1,25 µl)
⇒ N = n / V
Astuce:le nombre d'éléments dans 4 bandes (5mm)le nombre totale est divise par 5(nbre /mm ) ou la moyenne de 3 multipliée par 0,8
Si comptage effectué sur du liquide dilué : ne pas oublier de multiplier le nombre d'éléments comptés doit être multiplié par le taux de dilution.
L’examen après coloration
- Les techniques les plus communément utilisées au laboratoire de bactériologie médicale font appel à des colorations.
- La préparation est fixée sur une lame puis colorée.
☵ Coloration de bleu de Méthylène Voir
☵ Coloration de Gram Voir
☵ Coloration de coloration de Ziehl-Neelsen Voir
Ⅱ -2) Microscopie Optique à fond noir
- Le microscope à fond noir permet d’obtenir à partir d'échantillons transparents, avec un faible contraste, des images bien résolues, contrastées, sans nécessiter une coloration préalable de l'objet.
- Même des échantillons vivants sont observables ainsi.
- Elle conduit à un arrière-plan sombre de l'image, sur lequel les structures à observer se détachent en clair.
Saccharomyces cerevisiae observé au microscope à fond clair
Saccharomyces cerevisiae observé au microscope à fond noir
Principe
Les objets ne font pas qu'absorber la lumière, mais aussi qu'ils en dévient une partie. Si l'éclairage est disposé de façon que les rayons directs, non déviés, n'atteignent pas l'objectif, l'observateur ne voit que des rayons déviés.
Seule la lumière déviée par l'échantillon atteint l'objectif. Le fond de l'image apparaît donc sombre, tandis que les objets de l'échantillon paraissent clairs.
Le diaphragme présente un bord ou anneau transparent, et fait que le condensateur ne reçoit que la lumière des cotés. La partie interne du condensateur n'est pas éclairée.
- La lumière provenant du condenseur est focalisé sur le plan de l'échantillon. Pour pénétrer dans l'objectif, la lumière doit avoir été déviée par l'échantillon à observer, et elle forme ainsi une image avec des structures claires. La lumière non déviée passe entièrement à côté de l'ouverture de l'objectif, et l'arrière-plan de l'image reste sombre.
Applications
Les spirochètes ne sont pas visualisés en microscopie classique car leur diamètre est inférieur au
pouvoir de résolution d'un microscope optique, mais sont observables par microscopie à fond noir, au grossissement ×1000 ou plus.
Avantages
- Elle permet d'observer les tréponèmes mobiles, à spires régulières et réfringentes.
Inconvénients
- Cette méthode ne permet pas la différenciation des tréponèmes pathogènes des tréponèmes saprophytes (présents au niveau des revêtements cutanéo-muqueux) et nécessite un préleveur et un lecteur expérimentés.
Ⅱ -3) Microscopie Optique à contraste de phase:
Historique
Cet instrument fut développé par le physicien hollandais Frederik Zernike dans les années 1930, ce qui lui valut le prix Nobel de physique en 1953.
Définition
Transforme en niveaux de contraste les différences d'indices de réfraction entre deux structures, lesquelles se traduisent en différences de phase pour les ondes lumineuses les traversant.
- Visualise ainsi des structures transparentes quand leur indice de réfraction diffère de celui de leur voisinage.
- Permet d'observer des échantillons avec un contraste faible ou nul qui ne peuvent être observés avec un microscope à fond clair.
Le trajet lumineux dans un microscope à contraste de phase
- Ces microscopes sont équipés d'objectifs et d'un condenseur spécifiques pour le contraste de phase (deux dispositifs, appelés anneaux de phase, sont placés l'un dans le condensateur et l'autre dans l'objectif.
- La lumière qui traverse l’échantillon subit un déphasage par rapport aux autres rayons lumineux. Les anneaux filtrent ces rayons déphasés et il en résulte une image avec un contraste accentué (l’existence d’un halo clair autour des détails sombres).
Photographie d'un cellule épithéliale vue par un Microscope à contraste de phase
Spirillum volutens en microscope à contraste de phase
Application
-Le microscope à contraste de phase est utilisable pour des échantillons non fixés non colorer.
- Il est utile pour visualiser les structures internes et les organites des bactéries, champignons et protozoaires.
- En microbiologie :
- Il est spécialement utilisé pour détecter des constituants bactériens tels que les endospores , les inclusions…….
- Il serve aussi à l’étude des cellules eucaryotes
Clostridium botulinum avec des endospores ovales subterminales en microscope à contraste de phase (X 600).
Le microscope à contraste interférentiel (Nomarski Microscopy)
- Développée par le physicien Georges Nomarski dans les années 1950, avec l'invention des prismes qui portent son nom.
- Le microscope à contraste interférentiel repose sur un principe différent de celui du microscope à contraste de phase mais produit le même type d'image et a le même domaine d'utilisation
le trajet des rayons dans un microscope CID.
- les prismes génèrent deux rayons de lumière polarisée dans des plans perpendiculaires l’un à l’autre.
un rayon passe à travers l’échantillon tandis que l’autre traverse une zone claire de la lame .
Après ce passage les deux rayons sont recombinés et interférent l’un avec l’autre pour former une image.
L’image apparait ainsi en trois dimensions et avec des couleurs vives et on observe la diffference entre le MI et M C P
