Ⅰ.
Généralité
Les membres des genres Staphylococcus, Micrococcus, Kocuria
et Kytococcus sont caractérisés comme
étant des cocci à
Gram positif à catalase positive
à disposition en
paires, tétrades et en grappes.
◇ Traditionnellement, en fonction de leur capacité à coaguler
le
plasma de lapin, les
membres du genre Staphylococcus
ont été divisés en ceux qui sont à coagulase positive, c'est-à-dire Staphylococcus
aureus, et ceux
qui sont appelés
staphylocoques à coagulase négative (SCN),
c'est-à-dire tous
les autres
Staphylococcus (En particulier
Staphylococcus
epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus
lugdunensis
et Staphylococcus
schleiferi ).
◇ Plusieurs espèces qui appartenaient autrefois au genre
Micrococcus et qui
auraient joué un rôle dans
les infections
humaines ont été reclassées dans les genres Kocuria et Kytococcus. Malgré la reclassification,
collectivement ces
organismes sont souvent appelés microcoques.
Ⅱ. Culture
Lors d'une incubation à 35 °C pendant 24 à 48 h, les staphylocoques se développent rapidement sur une variété de milieux, avec des colonies qui varient 1 à 3 mm de diamètre en 24 h et 3 à 8
mm de
diamètre
après 72
h d'incubation (Les exceptions sont celles de S. aureus subsp. anaerobius, S. saccharolyticus, S. auricularis, S.
equorum, S.
vitulinus et S. lentus, qui se développent plus lentement et nécessitent généralement de 24 à 36 h pour un développement détectable des colonies).
◇ Staphylococcus aureus sur la gélose au sang , la colonie typique
est pigmentée
(crème /gris /
gris-blanc avec une teinte
jaunâtre allant du jaune à l'orange), lisse, entière, légèrement surélevée et hémolytique .
Les colonies mucoïdes dues à des souches fortement encapsulées sont rarement rencontrées.
◇ Les variants formant colonies naines (VCS) de Staphylococcus sont
caractérisés par
des colonies ponctuelles (1/10 de la taille du type sauvage), pour la plupart non pigmentées et non
hémolytiques
après 24 à 72 h d'incubation
Les VCS sont souvent mélangés avec des colonies affichant le phénotype
normal,
donnant ainsi
l'apparence d'une
culture mixte (une caractéristique phénotypique partagée par plusieurs souches
hétéro-résistantes de
SARM).
Lors du repiquage, ils peuvent rester stables ou revenir au type sauvage (En fonction de leur
auxotrophie, la croissance normale peut être rétablie si l'isolat est cultivé en présence
d'hémine, de
ménadione ou de thymidine et / ou une supplémentation en CO2).
☰ Figure (1):
- Flèches: Le phénotype normal est constitué de colonies grisâtres avec une
teinte jaunâtre entourée d'une zone d'hémolyse
- Flèches en pointillés: le phénotype de petite colonie est caractérisé par de
minuscules colonies non hémolytiques et non pigmentées
Figure (1)- Flèches en pointillés : variants formant colonies naines
◇ Les staphylocoques à coagulase négative, en particulier S. epidermidis, produisent des colonies
blanches ;
cependant, d'autres
souches et espèces de
SCN peuvent avoir des colonies avec un léger pigment crème. En général, les souches
SCN sont non
hémolytiques ;
cependant, certains produisent une petite zone de bêta-hémolyse sur la gélose au sang (par exemple,
S. haemolyticus
et S. lugdunensis)
◇ Les Microcoques, en plus de former des paires et des grappes,
peuvent
apparaître
comme des tétrades.
Comme les
staphylocoques, ils peuvent être facilement cultivés en laboratoire et peuvent être
récupérés à
partir de divers
milieux. Cependant, par rapport aux staphylocoques, leur croissance est plus lente, avec des
colonies plus petites
présentes après 24 h d'incubation à 35 ° C. De plus, selon l'espèce, la couleur de la colonie peut
aller du crème au
jaune (M. luteus).
☰ Comme S. aureus est fréquemment isolé dans des cultures mixtes, des
milieux sélectifs et
différentiels sont
utilisés
pour faciliter la détection de ces organismes dans le matériel clinique :
- Sur milieu de Chapman : Colonies jaunes pour le S.aureus
(fermentation du mannitol)
- Milieu de Baird-Parker : surtout utilisé en bactériologie
alimentaire. Le
S.aureus donne des
colonies noires (réduction du tellurite) avec un halo clair suivi d’une opacification tardive du
halo (lipase).
- Les milieux chromogènes : fondés sur la dégradation d'un substrat en métabolite
coloré spécifique
d'espèce.
Ⅲ. Staphylococcus
: Identification du
genre
❶ En plus de leur morphologie distinctive de coloration de
Gram (Cocci à Gram positif en paires et en
grappes), une
caractéristique commune de ces organismes est qu'ils sont catalase positifs.
La détection de la présence de la catalase chez les bactéries
(Cocci à Gram positif en paires et en grappes)
est essentielle pour différencier les
Staphylococcus et les
Micrococcaceae
catalase-positive des Streptococcaceae catalase-négative
NB. La catalase est un caractère constant chez les staphylocoques, malgré quelques rares cas
rapportés de S. aureus à
catalase négative .
❷ La différenciation entre le genre Staphylococcus et le genre Micrococcus
n’est pas toujours
évidente en raison d’une ressemblance des colonies sur gélose et le catalase positive. Cependant, il
existe certains
critères permettant de distinguer entre les deux genres :
|
Staphylococcus |
Micrococcus |
Oxydase |
- |
+ |
Bacitracine |
(R) |
(S) |
Nitrofurantoine |
(S) |
(R) |
Composé vibriostqtique O129 |
(R) |
(S) |
Sensibilité à la lysostaphine |
(S) |
(R) |
NB :
- les staphylocoques sont oxydase négative (sauf S. sciuri, S.
lentus, S. vitulinus et
S. fleurettii)
- Les microcoques, après coloration de Gram, sont des gros cocci (par rapport au
staphylocoque) à Gram
positif disposés souvent en
tétrade
- La Sensibilité à la lysostaphine : le S. aureus est très sensible, S.
saprophyticus
est
moins
sensible
en raison de la
teneur en sérine de son pont
pentapeptidique. Les microcoques ne sont pas sensibles à la lysostaphine.
- Contrairement aux staphylocoques, les «microcoques» sont caractérisés par l'absence
de
production d'acide à partir du glucose dans des conditions anaérobies
(non-fermentaire).
TSI Microcoque vs TSI S.aureus
Ⅳ. Staphylococcus : Identification de
l'espèce
L'espèce Staphylococcus aureus, considérée le plus fréquemment comme pathogène
pour
l'homme, doit être
identifiée et
différenciée des SCN et tout particulièrement des espèces les plus
retrouvées en pathologie humaine,
à savoir S.
epidermidis, S. haemolyticus ou encore S. saprophyticus
☰ Coagulase
Un critère largement utilisé pour l'identification de Staphylococcus aureus en laboratoire clinique est la
coagulation du plasma
prouvée par deux tests différents :
- Détection de la coagulase libre extracellulaire par le test en tube due à
la
coagulase
staphylococcique, qui
convertit le fibrinogène en fibrine,
- Détection de la coagulase liée à la paroi cellulaire (c'est-à-dire le
facteur
d'agglutination
(clumping
factor)) par le test d'agglutination sur lame.
❏ Le test de coagulase en tube est réalisé en transférant une grande colonie
bien
isolée d'une gélose
non inhibitrice
dans 0,5 ml de plasma de lapin reconstitué. Il est essentiel d'incuber le tube à 37 ° C pendant
4 h
et d'observer le
tube pour la formation de caillots en inclinant lentement le tube à 90 ° de la verticale.
Tout degré de coagulation représente un test positif (Un précipité floculant ou fibreux n'est
pas un
véritable
caillot et doit être enregistré comme négatif). Si aucun caillot ne se forme après 4 h, le tube
doit
être relu après
18 h d'incubation à 37 ° C
Des résultats faussement négatifs peuvent survenir pour certaines souches produisant de
la
staphylokinase
(fibrinolysine), qui peuvent lyser le caillot après sa formation (généralement après une
incubation
prolongée)
NB: Pour le test de coagulase en tube, les organismes utilisant du citrate tels que
Enterococcus faecalis, les espèces Pseudomonas, Serratia marcescens et certains souches de
Streptococcus
coaguleront le plasma citraté.
- S. hyicus, S. intermedius, S. pseudintermedius et S. schleiferi peuvent être coagulase positifs.
❏ La coagulase liée (facteur d'agglutination) peut être détectée par un test
d'agglutination sur lame,
dans lequel une
suspension de l'organisme est émulsionnée sur une lame avec une goutte de plasma de lapin. Si la
coagulase liée est
présente, les organismes s'agglutinent. Pour une interprétation correcte de ce test, un contrôle
dans lequel une
solution saline est utilisée à la place du plasma est nécessaire pour vérifier
l'auto-agglutination.
Parmi les SCN, S. lugdunensis et S. schleiferi peuvent également être testés positifs pour la
coagulase liée .
☰ Test d'agglutination
Pour surmonter la faible sensibilité et la spécificité du test d'agglutination sur lame classique
et
du long temps
d'incubation du test de coagulase en tube, des tests rapides au latex et d'hémagglutination
permettant
l'identification présomptive de S. aureus ont été développés.
Outre la détection de la protéine A (qui possède une affinité pour le «fragment
cristallisable»
(Fc) des immunoglobulines gamma (IgG)) et du facteur d'agrégation «clumping factor»
(facteur
d’affinité pour le fibrinogène), les tests de
troisième
génération
incluent des
anticorps monoclonaux reconnaissant les sérotypes de polysaccharides capsulaires les plus
répandus
sur le plan
clinique (1,
5, 6, 8, 10) (par exemple, Pastorex Staph-Plus [Bio-Rad]; Slidex Staph Plus [bioMérieux] et
Staphaurex Plus et
Staphytect Plus [Oxoid]).
La sensibilité plus élevée (> 98 à 100%) des tests de troisième génération a réduit leur
spécificité
(72 à 99%). Des
réactions faussement positives se produisent avec certaines souches SCN (S. haemolyticus et
S.
hominis) possédant un
polysaccharide capsulaire de type 8 ou une hémagglutinine de la paroi cellulaire (S.
saprophyticus) ou encore Staphylococcus lugdunensis et Staphylococcus
schleiferi
qui possédent un
facteur d’affinité pour le fibrinogène
NB: Certaines souches de Staphylococcus aureus (principalement
celles résistantes à la méticilline) ne sont pas agglutinées par ces tests (ces souches peuvent
exprimer des concentrations de facteur
d’agglutination et de protéine A indécelables)
☰ DNase test
Les souches de S. aureus qui produisent une faible réaction de coagulase peuvent être testées par
le
test DNase .
S. aureus et S. schleiferi possèdent des enzymes capables de dégrader l'ADN. La gélose à l’acide
désoxyribonucléique (A.D.N.) est un milieu destiné à la mise en évidence de la désoxyribonucléase
des
bactéries (Les bactéries possédant une désoxyribonucléase hydrolysent l’ A.D.N)
La zone d’hydrolyse est mise en évidence par l’addition d’acide chlorhydrique à la surface du milieu,
ce qui provoque la
précipitation de l’A.D.N. et l’opacification du milieu. Il y a présence d’un halo clair autour de la
culture si l’A.D.N a été hydrolysé.
☰ PNA FISH
PNA FISH pour la différenciation de Staphylococcus aureus de SCN dans les hémocultures.
PNA FISH est un test d'hybridation fluorescente in situ (FISH) de 90 minutes utilisant un
acide
nucléique peptidique marqué par fluorescence (PNA).
Elle est réalisée directement à partir de flacons d'hémoculture positifs pour les cocci à
Gram
positif en grappes. Dans l'exemple
présenté (photo 'ASM') , les cocci à Gram positif sont S. aureus, qui s'est hybridé avec une
sonde
fluorescente verte.
☰ La résistance à la novobiocine
La résistance à la novobiocine est intrinsèque à S.
saprophyticus, mais elle est
rare chez les
autres espèces SCN
cliniquement importantes.
Un test de diffusion sur disque pour estimer la sensibilité à la novobiocine peut être
réalisé en utilisant
un disque de novobiocine de 5 μg sur de la gélose Mueller-Hinton.
Avec une suspension
d'inoculum
équivalente en turbidité à un étalon d'opacité de 0,5 McFarland et une incubation à 35 à
37
° C pendant
une nuit ou jusqu'à 24 h, la résistance à la novobiocine est indiquée par un diamètre de
zone d'inhibition
≤ 16 mm.
☰ Test ornithine décarboxylase
Test ornithine décarboxylase pour l'identification de Staphylococcus lugdunensis. Contrairement à
la
plupart des
autres espèces CoNS, S. lugdunensis est ornithine décarboxylase positive.
Le milieu décarboxylase contenant 1% d'ornithine est inoculé et incubé pendant une nuit.
Étant donné
que certaines
souches de S. epidermidis peuvent également être positives à 24 h, l'échantillon doit
être
examiné à
8 h, moment
auquel S. lugdunensis est positif mais S. epidermidis est toujours négatif.
☰ Photo:
- L'isolat de gauche, S. saprophyticus, est négatif car il est jaune, indiquant
uniquement
la
fermentation du
glucose;
- cependant, S. lugdunensis (à droite) est positif, comme le montre la couleur rose
résultant de
l'alcalinisation
du
milieu.
Ⅴ. L’identification
complète
☰ Identification biochimique
La galerie biochimique d'identification : API Staph®, ID 32 Staph® et RAPIDEC
Staph®
API®. Staph est un système standardisé pour l'identification des genres Staphylococcus,
Micrococcus et. Kocuria comprenant des tests biochimiques miniaturisés. Chaque bandelette
de test se compose de 20 microtubes, y
compris
le puits de
contrôle négatif.
Après incubation de 24H vous allez lire votre API En fonction des variations des couleurs. Télécharger le
manuel API staph pdf
☰ Identification basées sur les acides
nucléiques
L'extraction des acides nucléiques staphylococciques peut être difficile en
raison de la nature
Gram-positive des
staphylocoques, qui nécessite des conditions spéciales pour la lyse de la paroi cellulaire. A
cet
effet, la
lysostaphine, la lysozyme, la protéinase K et l'achromopeptidase ont été utilisées.
Des tests basés sur l'amplification spécifique de fragments des gènes universels d'ARNr 16S et
23S ont été publiés. D'autres cibles ADN universelles qui se sont révélées
utiles
pour l'identification des staphylocoques comprennent le gène du facteur d'élongation
(tuf), le
gène
de la gyrase (gyrA), le gène de la superoxyde dismutase dépendant du
manganèse
(sodA), le gène
codant pour la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase ( gap) et une
protéine de choc
thermique de
60 kDa (HSP60 / GroE).
La cible spécifique la plus populaire et la mieux étudiée pour l'identification de S. aureus est
le
gène nuc , qui code pour la nucléase thermostable (thermonucléase ou TNase).
Les méthodes de PCR ciblant le nuc sont très spécifiques de S. aureus. Une PCR spécifique pour
le
gène S. intermedius nuc a également été décrite.
D'autres cibles spécifiques utilisées pour l'identification de S.aureus comprennent les gènes
codant
pour le facteur d'agrégation (clfA), la coagulase (coa), la superoxyde dismutase dépendant du
manganèse (sodM, absente dans CoNS), les facteurs essentiels pour l'expression de la résistance
à la
méthicilline (femA et -B) et (pour le SARM uniquement) l'élément d'insertion staphylococcique
431.
Une identification erronée à l'aide des facteurs fem peut se produire en raison de souches de S.
aureus fem négatives et de CoNS avec un gène structurellement lié à femA.
Ⅵ. Sensibilité aux
antibiotiques et traitement des staphylocoques
❏ Des anti-staphylococciques existent dans toutes les familles d’antibiotiques ( hormis
les polymyxines et les imidazolés ). Les anti-staphylococciques les plus utilisés appartiennent aux
familles suivantes : les bêtalactamines ( l’oxacilline du groupe des pénicillines M ), les
glycopeptides ( vancomycine ou teicoplanine ) en cas de résistance ou d’intolérance à cette première
classe, les aminosides ( gentamicine ), qui permettent d’obtenir une bactéricidie rapide en
association à l’une des deux classes précédentes, et les fluoroquinolones.
❏ D’autres antibiotiques sont également utilisés : les streptogramines (pristinamycine), les
macrolides, la
clindamycine, le cotrimoxazole, la rifampicine, l’acide fusidique et la fosfomycine. Ces trois
dernières molécules
sont données en association du fait des fréquences élevées de mutations.
ⅥⅠ. Antibiotiques
à
tester
"Staphylocoques "
❏ L'antibiogramme de Staphylocoque est réalisé sur gélose de Mueller-Hinton, Inoculum :
0,5
McFarland
☰ Antibiogramme du Staphylocoque selon la Standardisation
Algérienne
Pénicilline (1O UI) , Oxacilline (CMI seulement) , Céfoxitine (30µg) ,
Amikacine (30µg) ,
Gentamicine (10 µg) , Kanamycine (30µg) , Erythromycine (15µg) , Clindamycine (2µg) , Pristinamycine
(15µg)
/Quinupristine-dalfopristine (15µg) ,
Ofloxacine (5µg) , Ciprofloxacine (5µg) , Lévofloxacine (5µg) , Chloramphénicol (30µg) ,Vancomycine
(CMI seulement), Teicoplanine (30µg) , Rifampicine (5µg) , Triméthoprime + sulfaméthoxazole (1
.25/23.
75 µg) , Tétracycline (30µg) , Acide fusidique (1 0μg),
Fosfomycine (IV),
Composé vibriostatique 0/129
☰ Antibiogramme de Staphylocoque selon CASFM
Liste standard : Pénicilline G ,
Céfoxitine ,
Gentamicine ,
Erythromycine ,
Clindamycine ,
Quinupristine - dalfopristine ,
Norfloxacine,
Fluoroquinolone ,
Acide fusidique ,
Cotrimoxazole
Liste complémentaire : Oxacilline ,
Ceftaroline ,
Vancomycine ,
Teicoplanine ,
Kanamycine ,
Tobramycine ,
Netilmicine ,
Triméthoprime ,
Chloramphénicol ,
Tétracycline ,
Minocycline ,
Tigécycline ,
Linézolide ,
Nitrofurantoine ,
Daptomycine ,
Mupirocine ,
Fosfomycine
◈ Pour plus de details consultez Antibiogramme de Staphylocoque