Staphylococcus | Micrococcus | Culture | Identification | Diagnostic | Antibiogramme

Ⅰ. Généralité

Les membres des genres Staphylococcus, Micrococcus, Kocuria et Kytococcus sont caractérisés comme étant des cocci à Gram positif à catalase positive à disposition en paires, tétrades et en grappes.

◇ Traditionnellement, en fonction de leur capacité à coaguler le plasma de lapin, les membres du genre Staphylococcus ont été divisés en ceux qui sont à coagulase positive, c'est-à-dire Staphylococcus aureus, et ceux qui sont appelés staphylocoques à coagulase négative (SCN), c'est-à-dire tous les autres Staphylococcus (En particulier Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus lugdunensis et Staphylococcus schleiferi ).

◇ Plusieurs espèces qui appartenaient autrefois au genre Micrococcus et qui auraient joué un rôle dans les infections humaines ont été reclassées dans les genres Kocuria et Kytococcus. Malgré la reclassification, collectivement ces organismes sont souvent appelés microcoques.

Ⅱ. Culture

Lors d'une incubation à 35 °C pendant 24 à 48 h, les staphylocoques se développent rapidement sur une variété de milieux, avec des colonies qui varient 1 à 3 mm de diamètre en 24 h et 3 à 8 mm de diamètre après 72 h d'incubation (Les exceptions sont celles de S. aureus subsp. anaerobius, S. saccharolyticus, S. auricularis, S. equorum, S. vitulinus et S. lentus, qui se développent plus lentement et nécessitent généralement de 24 à 36 h pour un développement détectable des colonies).

◇ Staphylococcus aureus sur la gélose au sang , la colonie typique est pigmentée (crème /gris / gris-blanc avec une teinte jaunâtre allant du jaune à l'orange), lisse, entière, légèrement surélevée et hémolytique .

Les colonies mucoïdes dues à des souches fortement encapsulées sont rarement rencontrées.

◇ Les variants formant colonies naines (VCS) de Staphylococcus sont caractérisés par des colonies ponctuelles (1/10 de la taille du type sauvage), pour la plupart non pigmentées et non hémolytiques après 24 à 72 h d'incubation

◇ Les staphylocoques à coagulase négative, en particulier S. epidermidis, produisent des colonies blanches ; cependant, d'autres souches et espèces de SCN peuvent avoir des colonies avec un léger pigment crème. En général, les souches SCN sont non hémolytiques ; cependant, certains produisent une petite zone de bêta-hémolyse sur la gélose au sang (par exemple, S. haemolyticus et S. lugdunensis)

◇ Les Microcoques, en plus de former des paires et des grappes, peuvent apparaître comme des tétrades. Comme les staphylocoques, ils peuvent être facilement cultivés en laboratoire et peuvent être récupérés à partir de divers milieux. Cependant, par rapport aux staphylocoques, leur croissance est plus lente, avec des colonies plus petites présentes après 24 h d'incubation à 35 ° C. De plus, selon l'espèce, la couleur de la colonie peut aller du crème au jaune (M. luteus).

☰ Comme S. aureus est fréquemment isolé dans des cultures mixtes, des milieux sélectifs et différentiels sont utilisés pour faciliter la détection de ces organismes dans le matériel clinique :

• Sur milieu de Chapman : Colonies jaunes pour le S.aureus (fermentation du mannitol)
• Milieu de Baird-Parker : surtout utilisé en bactériologie alimentaire. Le S.aureus donne des colonies noires (réduction du tellurite) avec un halo clair suivi d’une opacification tardive du halo (lipase).
• Les milieux chromogènes : fondés sur la dégradation d'un substrat en métabolite coloré spécifique d'espèce.

Ⅲ. Staphylococcus : Identification du genre

❶ En plus de leur morphologie distinctive de coloration de Gram (Cocci à Gram positif en paires et en grappes), une caractéristique commune de ces organismes est qu'ils sont catalase positifs.

La détection de la présence de la catalase chez les bactéries (Cocci à Gram positif en paires et en grappes) est essentielle pour différencier les Staphylococcus et les Micrococcaceae catalase-positive des Streptococcaceae catalase-négative

NB. La catalase est un caractère constant chez les staphylocoques, malgré quelques rares cas rapportés de S. aureus à catalase négative .

❷ La différenciation entre le genre Staphylococcus et le genre Micrococcus n’est pas toujours évidente en raison d’une ressemblance des colonies sur gélose et le catalase positive. Cependant, il existe certains critères permettant de distinguer entre les deux genres :

Ⅳ. Staphylococcus : Identification de l'espèce

L'espèce Staphylococcus aureus, considérée le plus fréquemment comme pathogène pour l'homme, doit être identifiée et différenciée des SCN et tout particulièrement des espèces les plus retrouvées en pathologie humaine, à savoir S. epidermidis, S. haemolyticus ou encore S. saprophyticus

☰ Coagulase

Un critère largement utilisé pour l'identification de Staphylococcus aureus en laboratoire clinique est la coagulation du plasma prouvée par deux tests différents :

1. Détection de la coagulase libre extracellulaire par le test en tube due à la coagulase staphylococcique, qui convertit le fibrinogène en fibrine,
2. Détection de la coagulase liée à la paroi cellulaire (c'est-à-dire le facteur d'agglutination (clumping factor)) par le test d'agglutination sur lame.

❏ Le test de coagulase en tube est réalisé en transférant une grande colonie bien isolée d'une gélose non inhibitrice dans 0,5 ml de plasma de lapin reconstitué. Il est essentiel d'incuber le tube à 37 ° C pendant 4 h et d'observer le tube pour la formation de caillots en inclinant lentement le tube à 90 ° de la verticale.

Tout degré de coagulation représente un test positif (Un précipité floculant ou fibreux n'est pas un véritable caillot et doit être enregistré comme négatif). Si aucun caillot ne se forme après 4 h, le tube doit être relu après 18 h d'incubation à 37 ° C

Des résultats faussement négatifs peuvent survenir pour certaines souches produisant de la staphylokinase (fibrinolysine), qui peuvent lyser le caillot après sa formation (généralement après une incubation prolongée)

NB: Pour le test de coagulase en tube, les organismes utilisant du citrate tels que Enterococcus faecalis, les espèces Pseudomonas, Serratia marcescens et certains souches de Streptococcus coaguleront le plasma citraté.

- S. hyicus, S. intermedius, S. pseudintermedius et S. schleiferi peuvent être coagulase positifs.

❏ La coagulase liée (facteur d'agglutination) peut être détectée par un test d'agglutination sur lame, dans lequel une suspension de l'organisme est émulsionnée sur une lame avec une goutte de plasma de lapin. Si la coagulase liée est présente, les organismes s'agglutinent. Pour une interprétation correcte de ce test, un contrôle dans lequel une solution saline est utilisée à la place du plasma est nécessaire pour vérifier l'auto-agglutination.

Parmi les SCN, S. lugdunensis et S. schleiferi peuvent également être testés positifs pour la coagulase liée .

☰ Test d'agglutination

Pour surmonter la faible sensibilité et la spécificité du test d'agglutination sur lame classique et du long temps d'incubation du test de coagulase en tube, des tests rapides au latex et d'hémagglutination permettant l'identification présomptive de S. aureus ont été développés.

Outre la détection de la protéine A (qui possède une affinité pour le «fragment cristallisable» (Fc) des immunoglobulines gamma (IgG)) et du facteur d'agrégation «clumping factor» (facteur d’affinité pour le fibrinogène), les tests de troisième génération incluent des anticorps monoclonaux reconnaissant les sérotypes de polysaccharides capsulaires les plus répandus sur le plan clinique (1, 5, 6, 8, 10) (par exemple, Pastorex Staph-Plus [Bio-Rad]; Slidex Staph Plus [bioMérieux] et Staphaurex Plus et Staphytect Plus [Oxoid]).

La sensibilité plus élevée (> 98 à 100%) des tests de troisième génération a réduit leur spécificité (72 à 99%). Des réactions faussement positives se produisent avec certaines souches SCN (S. haemolyticus et S. hominis) possédant un polysaccharide capsulaire de type 8 ou une hémagglutinine de la paroi cellulaire (S. saprophyticus) ou encore Staphylococcus lugdunensis et Staphylococcus schleiferi qui possédent un facteur d’affinité pour le fibrinogène

NB: Certaines souches de Staphylococcus aureus (principalement celles résistantes à la méticilline) ne sont pas agglutinées par ces tests (ces souches peuvent exprimer des concentrations de facteur d’agglutination et de protéine A indécelables)

☰ DNase test

Les souches de S. aureus qui produisent une faible réaction de coagulase peuvent être testées par le test DNase .

S. aureus et S. schleiferi possèdent des enzymes capables de dégrader l'ADN. La gélose à l’acide désoxyribonucléique (A.D.N.) est un milieu destiné à la mise en évidence de la désoxyribonucléase des bactéries (Les bactéries possédant une désoxyribonucléase hydrolysent l’ A.D.N)

La zone d’hydrolyse est mise en évidence par l’addition d’acide chlorhydrique à la surface du milieu, ce qui provoque la précipitation de l’A.D.N. et l’opacification du milieu. Il y a présence d’un halo clair autour de la culture si l’A.D.N a été hydrolysé.

☰ PNA FISH

☰ La résistance à la novobiocine

☰ Test ornithine décarboxylase

Test ornithine décarboxylase pour l'identification de Staphylococcus lugdunensis. Contrairement à la plupart des autres espèces CoNS, S. lugdunensis est ornithine décarboxylase positive.

Ⅴ. L’identification complète

☰ Identification biochimique

La galerie biochimique d'identification : API Staph®, ID 32 Staph® et RAPIDEC Staph®

☰ Identification basées sur les acides nucléiques

L'extraction des acides nucléiques staphylococciques peut être difficile en raison de la nature Gram-positive des staphylocoques, qui nécessite des conditions spéciales pour la lyse de la paroi cellulaire. A cet effet, la lysostaphine, la lysozyme, la protéinase K et l'achromopeptidase ont été utilisées.

Des tests basés sur l'amplification spécifique de fragments des gènes universels d'ARNr 16S et 23S ont été publiés. D'autres cibles ADN universelles qui se sont révélées utiles pour l'identification des staphylocoques comprennent le gène du facteur d'élongation (tuf), le gène de la gyrase (gyrA), le gène de la superoxyde dismutase dépendant du manganèse (sodA), le gène codant pour la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase ( gap) et une protéine de choc thermique de 60 kDa (HSP60 / GroE).

La cible spécifique la plus populaire et la mieux étudiée pour l'identification de S. aureus est le gène nuc , qui code pour la nucléase thermostable (thermonucléase ou TNase). Les méthodes de PCR ciblant le nuc sont très spécifiques de S. aureus. Une PCR spécifique pour le gène S. intermedius nuc a également été décrite. D'autres cibles spécifiques utilisées pour l'identification de S.aureus comprennent les gènes codant pour le facteur d'agrégation (clfA), la coagulase (coa), la superoxyde dismutase dépendant du manganèse (sodM, absente dans CoNS), les facteurs essentiels pour l'expression de la résistance à la méthicilline (femA et -B) et (pour le SARM uniquement) l'élément d'insertion staphylococcique 431. Une identification erronée à l'aide des facteurs fem peut se produire en raison de souches de S. aureus fem négatives et de CoNS avec un gène structurellement lié à femA.

Ⅵ. Sensibilité aux antibiotiques et traitement des staphylocoques

❏ Des anti-staphylococciques existent dans toutes les familles d’antibiotiques ( hormis les polymyxines et les imidazolés ). Les anti-staphylococciques les plus utilisés appartiennent aux familles suivantes : les bêtalactamines ( l’oxacilline du groupe des pénicillines M ), les glycopeptides ( vancomycine ou teicoplanine ) en cas de résistance ou d’intolérance à cette première classe, les aminosides ( gentamicine ), qui permettent d’obtenir une bactéricidie rapide en association à l’une des deux classes précédentes, et les fluoroquinolones.

❏ D’autres antibiotiques sont également utilisés : les streptogramines (pristinamycine), les macrolides, la clindamycine, le cotrimoxazole, la rifampicine, l’acide fusidique et la fosfomycine. Ces trois dernières molécules sont données en association du fait des fréquences élevées de mutations.

ⅥⅠ. Antibiotiques à tester "Staphylocoques "

❏ L'antibiogramme de Staphylocoque est réalisé sur gélose de Mueller-Hinton, Inoculum : 0,5 McFarland

☰ Antibiogramme du Staphylocoque selon la Standardisation Algérienne

Pénicilline (1O UI) , Oxacilline (CMI seulement) , Céfoxitine (30µg) , Amikacine (30µg) , Gentamicine (10 µg) , Kanamycine (30µg) , Erythromycine (15µg) , Clindamycine (2µg) , Pristinamycine (15µg) /Quinupristine-dalfopristine (15µg) , Ofloxacine (5µg) , Ciprofloxacine (5µg) , Lévofloxacine (5µg) , Chloramphénicol (30µg) ,Vancomycine (CMI seulement), Teicoplanine (30µg) , Rifampicine (5µg) , Triméthoprime + sulfaméthoxazole (1 .25/23. 75 µg) , Tétracycline (30µg) , Acide fusidique (1 0μg), Fosfomycine (IV), Composé vibriostatique 0/129

☰ Antibiogramme de Staphylocoque selon CASFM

Liste standard : Pénicilline G , Céfoxitine , Gentamicine , Erythromycine , Clindamycine , Quinupristine - dalfopristine , Norfloxacine, Fluoroquinolone , Acide fusidique , Cotrimoxazole

Liste complémentaire : Oxacilline , Ceftaroline , Vancomycine , Teicoplanine , Kanamycine , Tobramycine , Netilmicine , Triméthoprime , Chloramphénicol , Tétracycline , Minocycline , Tigécycline , Linézolide , Nitrofurantoine , Daptomycine , Mupirocine , Fosfomycine

◈ Pour plus de details consultez Antibiogramme de Staphylocoque