◈ Principe : L'hydrolyse de l'ADN sera observée par une clarification de la gélose après ajout d'HCl (les oligonucléotides se dissolvent dans l'acide, mais les sels d'ADN sont insolubles).
☰ Sommaire :
- Ⅰ. Introduction
- Ⅱ. Gélose pour DNase test / Principe
- Gélose DNase sans indicateur
- Gélose DNase avec vert de méthyle
- Gélose DNase avec bleu de toluidine
- Ⅲ. Procédure DNase test / Résultats
Ⅰ. Introduction
Test Désoxyribonucléase (DNase) est utilisé pour déterminer la capacité d'un organisme à hydrolyser l'ADN et à l'utiliser comme source de carbone et d'énergie pour la croissance. Utilisé principalement pour differencier le Staphylococcus aureus des autres Staphylocoques.
Les DNases sont des enzymes qui hydrolysent l'ADN et libèrent des nucléotides libres et du phosphate. Les DNases produites par les bactéries sont des endonucléases extracellulaires qui clivent l'ADN, produisant une forte concentration d'oligonucléotides.
Il existe plusieurs milieux utilisés pour détecter ces enzymes, certains n’utilisent aucun indicateur (nécessite l'ajout de réactif HCl ) et d'autres utilisent divers indicateurs (bleu de toluidine O ou vert de méthyle).
Ⅱ. Gélose pour DNase test / Principe
🏾 Gélose DNase sans indicateur
La formulation originale a été conçue par Jeffries et al., qui ont incorporé de l'ADN dans de la gélose trypticase soja; ce milieu nécessitait l'addition d'acide (HCL) pour détecter l'ADN polymérisé.
| Ingrédients | gram/litre | Ingrédients | gram/litre |
|---|---|---|---|
| Digestion pancréatique de caséine | 15,0 g | Digest papaique de tourteau de soja | 5,0 g |
| Chlorure de sodium | 5,0 g | Acide désoxyribonucléique | 2,0 g |
| Gélose | 15,0g |
DNase test négatif et positif après l'ajout d'HCL
🏾 Gélose DNase avec vert de méthyle
Décrit par P. B. SMITH et al, l'incorporation de colorant vert de méthyle dans un milieu gélosé contenant de l'acide désoxyribonucléique donne un milieu amélioré pour la détection de bactéries productrices de désoxyribonucléase. L'utilisation du colorant rend inutile l'utilisation d'acide pour démontrer activité désoxyribonucléase, permettant ainsi la sous-culture ou la réincubation des colonies.
Vert de méthyle ......................... 0,05g
◈ Principe : Le colorant vert de méthyle est capable de se lier à l'ADN polymérisé pour former un complexe vert stable à pH 7,3. L'action de la DNase dépolymérise la structure de l'ADN en libérant du vert de méthyle, le vert de méthyle libre se décolore spontanément à pH 7,3, ce qui donne des halos incolores autour des colonies positives à la DNase.
"A" et "B" DNase test positif, "C" DNase test négatif
🏾 Gélose DNase avec bleu de toluidine O
Décrit par Schreier, conçu initialement pour différencier facilement et rapidement S. marcescens des autres membres de la division KES : Klebsiella, Enterobacter, Serratia.
Bleu de toluidine O ........................ 0,1 g
◈ Principe : Lorsque le bleu de toluidine O (TBO) est ajouté, un complexe se forme avec l'ADN, qui change de structure lorsque l'ADN est hydrolysé, ce qui donne une couleur rose vif
Ⅲ. Procédure DNase test / Résultats
- Vous ferez une seule ligne au centre de la boite (si vous utilisez 2 espèces de staphylocoques, vous pouvez diviser la boite en deux et faire passer chaque organisme sur un côté).
- Incuber à 30º C ou 37º C.
- APRÈS INCUBATION : Si le milieu de DNase ne contient pas d’indicateur coloré : Inonder la boite avec de l'acide chlorhydrique à 1N et Laisser reposer la boite pendant quelques minutes pour permettre au réactif de s'adsorber. Décanter l’excès de l'acide chlorhydrique, puis examiner la boite dans les 5 minutes sur un fond sombre.
🏿 DNase test positif chez:
- 1. Serratia marcescens (Serratia fonticola est la seule Serratia sp. qui est négatif pour la DNase.)
- 2. Staphylococcus aureus
- 3. Campylobacter jejuni
- 4. Moraxella catarrhalis
- 5. Corynebacterium diphtheriae
Reference
- C D JEFFRIES- Rapid method for determining the activity of microorganisms on nucleic acids
- P. B. Smith - Improved Medium for Detecting Deoxyribonuclease-Producing Bacteria
- Schreier - Modification of Deoxyribonuclease Test Medium for Rapid Identification of Serratia marcescens
- TEXtBOOK Diagnostic Microbiology 4ed
- DALYANN - DNase TEST AGAR
- F.P. Pimenta - DNase test as a novel approach for the routine screening of Corynebacterium diphtheriae
- BD - DNase Test Agar
- BIOLOGY libretexts - Deoxyribonuclease (DNAse) Test
- T J Beveridge - Mechanism of gram variability in select bacteria
- CDC - DNase Test
- laboratoryinfo - Deoxyribonuclease (DNase) Test – Principle, Procedure, Uses, Result Interpretation