1. EQUIPEMENT :

-Etuve à 35°           -Agitateur

-Microscope optique binoculaire         -Centrifugeuse        -Bain-marie à 37°c et 100°c

2. MATERIEL :

-Lames               -Lamelles

-Pipette Pasteur en verre         -Cellule Nageotte

3. REACTIFS :

-Bleu de méthylène

-Colorants pour Gram (violet de gentiane, Lugol, alcool, fushine)

-Tubes d’eau physiologique stérile

-Milieux de culture :

                        -Gélose au sang frais (GSF)
                        -Gélose au sang cuit (GSC)
                        -Gélose au sans cuit avec supplément G (G)
                        -Bouillon cœur cervelle (BHIB)

-Pastorex meningitidis-Bio-Rad Réf. :61607

-Pastorex strep-Bio-Rad Réf. :61721

-Serum d’agglutination Streptococcus pneumoniae –Satens serum istitut

-Serums d’agglutination Pseudomonas aeruginosa-Bio-Rad

-Poudre de desoxycholate de sodium

-Facteurs de croissance-OXOID Réf. :

                                      X : DD0003L
                                     V : DD0004L
                                   XV : DD0005L 

4. PROTOCOLE :

4.1. Généralités :

↪ Les prélèvements sont ensemencés immédiatement après avoir vérifié le numéro d’enregistrement de la fiche de renseignement et du tube du prélèvement.

↪ Préparer et numéroter les géloses à ensemencer ainsi que les lames pour les colorations.

4.2. Germes recherchés :

4.3. Examen direct :

4.3.1. Macroscopie: noter l’aspect du LCR :

-Normal : clair eau de roche

-Pathologique :

-trouble

-hématique

-ictérique

4.3.2. Microscopie :

-La numération : se fait sur cellule Nageotte (LCR total)

-Noter le nombre des éléments blancs et rouges :

                        -LCR normal : <05 éléments blancs/mm (10 à 30 pour le nouveau né)
                        -LCR pathologique : >20 éléments blancs/mm

-La coloration : sur culot de centrifugation

Bleu de méthylène :

→ Tracer un cercle à l’aide d’un marqueur sur une lame

→ Déposer une goutte du liquide sur lame et laisser sécher à l’air

→ Faire une coloration au bleu de méthylène

→ Noter la présence ou l’absence de cellules : polynucléaires neutrophiles (PNN), lymphocytes (L) :

↪ PNN>50% : méningite bactérienne

↪ L>50% : méningite tuberculeuse, listerienne ou virale

↪ PNN=L=50% : méningite listerienne, purulente ou lymphocytaire au début, abcès cérébral

↪ Cas particulier : LCR sanglant : 1 élément blanc/800 hématies

Gram :

→ Présence ou absence de cocci ou bacilles à Gram positif ou négatif

4.3.3. Recherche des antigènes solubles :

Neisseria meningitidis A, C, Y/W135, B/E, Streptococcus pneumoniae,  
  Streptococcus agalactiae, E.coli K1, Haemophilus influenzae

→ Les examens bactériologiques doivent être pratiqués en priorité pour éviter les contaminations

→ Le LCR est chauffé (3mn à 100°c) et centrifugé (5mn à 3000t)

→ Déposer une goutte du surnageant + une goutte du réactif latex

→ Tester les temoins positif et négatif

→ Tester les temoins positif et négatif

4.4. Ensemencement et incubation :

→ Dés la réception du prélèvement au laboratoire prendre 3 goutte du LCR à l’aide d’une pipette Pasteur et ensemencer les milieux GSF, GSC, G et BHIB

-Incuber sous CO2 à 35° pendant 48h

4.5. Lecture et interpretation :

→ Lecture à 24h et 48h

→ Tout germe trouvé doit être identifié

→ Quand il s’agit d’un Staphylococcus à coagulase négative ou d’un Corynebacterium spp le résultat doit être confronté à la clinique en demandant un 2eme prélèvement si possible

4.6. Identification :

4.7. Antibiogramme :

→ Bactérie isolée : se référer au fascicule de standardisation de l’antibiogramme à l’échelle nationale