❍ Le gold standard pour le diagnostic du COVID-19 est la RT-PCR, ou reverse transcription-PCR. Dans les premiers jours de l'épidémie en Chine, la RT-PCR n'était sensible qu'à 30 à 70% alors que la TDM (tomodensitométrie) thoracique était beaucoup plus sensible dans ce contexte.
❍ Cependant, des données plus récentes des laboratoires américains de l'université de Washington suggèrent que les tests COVID RT-PCR de deuxième génération se portent beaucoup mieux, avec une sensibilité de plus de 95 %.
La RT-PCR est une technique qui permet de faire une PCR (réaction en chaîne par polymérase) à partir d'un échantillon d'ARN.
Procédure
- La transcriptase inverse utilise la matrice d'ARN pour produire un brin d’ADN (simple brin) complémentaire appelé ADNc dans un processus connu sous le nom de transcription inverse.
- Ensuite, l'ADN polymérase est utilisée pour convertir l'ADNc simple brin en ADN double brin. Ces molécules d'ADN peuvent maintenant être utilisées comme matrices pour une réaction PCR afin d'amplifier un fragment d'ADN et détecter indirectement l'ARN présent dans l'échantillon original.
❍ La RT-qPCR peut être réalisée en une ou deux étapes. Les tests one-step combinent la transcription inverse et la PCR dans un seul tube et un seul tampon, en utilisant une transcriptase inverse avec une ADN polymérase. Dans les tests two-step, les étapes de transcription inverse et de PCR sont réalisées dans des tubes séparés, avec des tampons optimisés, des conditions de réaction et des stratégies d'amorçage différents.
⚡ Trois approches différentes peuvent être utilisées pour amorcer les réactions de l'ADNc dans des tests two-step :
- - Les amorces oligo(dT) : des résidus de thymine qui s'hybrident à la queue poly(A) de l'ARN
- - Les amorces aléatoires : de six à neuf bases de long, elles s'hybrident en de multiples points le long du brin d’ARN,
- - Les amorces spécifiques d’une séquence : Des amorces sur mesure qui ciblent une séquence spécifique d'ARN.
- ✉ Souvent, un mélange d'oligo(dT) et d'amorces aléatoires est utilisé.
Les séquences cibles
❍ Parmi les génomes viraux liés au SRAS, ils ont découvert trois régions de séquences conservé :
- (1) le gène RdRP (gène de l'ARN polymérase ARN-dépendante) dans la région ORF1ab du cadre de lecture ouvert,
- (2) le gène E (gène de la protéine d'enveloppe),
- (3) le gène N (gène de la protéine de la nucléocapside).
Les gènes RdRP et E présentaient tous deux une sensibilité analytique élevée pour la détection (limite technique de détection de 3,6 et 3,9 copies par réaction), tandis que le gène N présentait une sensibilité analytique plus faible (8,3 copies par réaction).
- La transcriptase inverse est l'enzyme qui fabrique l'ADN à partir de l'ARN. Certaines enzymes ont une activité RNase pour dégrader le brin d'ARN dans l'hybride ARN-ADN après transcription inverse. Si une enzyme ne possède pas d'activité RNase, une RNaseH peut être ajoutée pour une meilleure efficacité de la PCR.
- Pour la RT-PCR, il est idéal de choisir une transcriptase inverse ayant une grande stabilité thermique, car cela permet d'effectuer la synthèse de l'ADNc à des températures plus élevées, assurant une transcription inverse réussie des ARN avec des niveaux élevés de structure secondaire, tout en maintenant leur pleine activité tout au long de la réaction produisant des rendements d'ADNc plus élevés.