Les tests de méthyle rouge et de Voges-Proskauer font partie d’une batterie de tests biochimiques appelée IMViC utilisée en laboratoire clinique. L'acronyme IMViC signifie indole, méthyl rouge, Voges-Proskauer et citrate. Le "i" dans l'acronyme est ajouté à des fins de prononciation.

À l’origine, les tests appariés MR-VP étaient utilisés pour distinguer les membres de la famille des Enterobacteriaceae, mais ils servent maintenant à caractériser d’autres groupes de bactéries, notamment les Actinobactéries.

Rouge de méthyle

- L'indicateur de pH rouge méthylique (acide p-diméthylaminoœobenzène-O-carboxylique) s'est révélé approprié pour mesurer la concentration en ions hydrogène entre pH 4,4 (rouge) et 6,0 (jaune)

- Lorsque le milieu de culture devient rouge après l'addition de rouge de méthyle, en raison d'un pH égal ou inférieur à 4,4 dû à la fermentation du glucose, la culture donne un résultat positif pour le test MR. Un test MR négatif est indiqué par une couleur jaune dans le milieu de culture, qui se produit lorsque moins d'acide est produit (le pH est plus élevé) à partir de la fermentation du glucose.

Voges-Proskauer

- Les bactéries fermentant les sucres via la voie du butanediol produisent de l'acétoïne (c'est-à-dire de l'acétylméthyl carbinol ou de la 3-hydroxybutanone) en tant qu'intermédiaire qui peut être réduit davantage en 2,3-butanediol

    2 pyruvate = acétoïne + 2CO 2
    acétoïne + NADH + H + = 2,3-butanediol + NAD +

- En présence de KOH, l'acétoïne intermédiaire est oxydée en diacétyle, réaction qui est catalysée par l'a-naphtol. Le diacétyle réagit avec le groupe guanidine associé aux molécules apportées par la peptone dans le milieu pour former un produit de couleur rouge rosé.

- L’a-naphtol dans la modification de Barritt du test VP sert d’intensificateur de couleur.

Les Réactifs :

- Bouillon tamponné peptone-glucose (disponible dans le commerce en tant que bouillon MR-VP)

- milieu de clark et lubs

- Solution de méthyle rouge : Dissolvez complètement 0,1 g de rouge de méthyle dans 300 ml d'éthanol (95%). Ajoutez 200 ml d’eau désionisée pour obtenir 500 ml d’une solution à 0,05% (poids / volume) dans de l’éthanol à 60% (volume / volume). Conservez la solution de rouge de méthyle préparée à 4 ° C.

- Réactifs de Voges-Proskauer :

• - Réactif de Barritt A : a-naphtol à 5% (poids / volume) dans l’éthanol absolu
• - Réactif de Barritt B : KOH à 40% (poids / volume) dans de l’eau désionisée (peut être remplacé par une solution de NaOH à 40% (poids / volume))
• - Les réactifs doivent être préparés à l'état frais. Les réactifs sont également appelés VP-1 et VP-2 ou VP-A et VP-B.

Le Protocole :

A. Inoculation du milieu

- Préparez le bouillon MR-VP comme décrit par le fabricant. Avant utilisation, laissez le milieu revenir à la température ambiante.

- Inoculer un tube de bouillon MR-VP à partir d'une culture pure fraîche (18 à 24 heures) (par exemple, cultivée sur gélose trypticase soja) de la culture à tester. Transférer un inoculum léger d’une colonie isolée et le remettre en suspension dans le tube à bouillon MR-VP de 5 ml. Notez que l'utilisation d'un inoculum lourd peut entraîner des résultats aberrants.

- Pour la comparaison, il est suggéré d'utiliser Escherichia coli (MR +, VP-) et Enterobacter aerogenes (MR-, VP +) comme cultures témoins.

B. Incubation

- Incuber le test et les cultures témoins à 35 ° C (+/- 2 ° C) pendant 48 heures.

C. Essai au rouge de méthyle et interprétation des résultats :

1-Transférer 2,5 ml de culture dans un nouveau tube de culture stérile.

2-Ajoutez 5 gouttes du réactif rouge de méthyle.

3-Comparez l'organisme testé aux cultures témoins pour interpréter immédiatement le résultat, MR positif (par exemple, E. coli) ou MR négatif (par exemple, E. aerogenes).

Des résultats faussement négatifs ou une couleur orange peu concluante peuvent se produire en raison de la longueur insuffisante de l’incubation. Dans ce cas, il est recommandé de répéter le test avec une culture incubée de 24 à 48 heures supplémentaires.

Une augmentation de la concentration de glucose dans le milieu peut entraîner des résultats faussement positifs au test RM. Clark et Lubs ont montré que l’augmentation de la concentration de glucose a également conduit à une concentration élevée d’ions hydrogène dans des cultures à ratio élevé qui, dans des conditions d’essai standard, sont négatives pour l’RM

D. Voges-Proskauer et interprétation des résultats :

-Utilisez les 2,5 ml de culture restants dans le bouillon MR-VP.

-Ajoutez 0,6 ml (ou 12 gouttes) de réactif de Barritt A.

-Ajoutez 0,2 ml (ou 4 gouttes) de réactif B de Barritt.

-Agiter soigneusement le tube pendant 30 secondes à 1 minute pour exposer le milieu à l'oxygène de l'air (nécessaire à l'oxydation de l'acétoïne pour obtenir une réaction de couleur).

-Laisser le tube reposer pendant au moins 30 minutes.

- En moins d'une heure, comparez le résultat du test aux cultures témoins pour déterminer si la culture est positive pour VP, comme E. aerogenes ou VP négative, comme E. coli . Une lecture tardive du résultat peut conduire à une lecture erronée. Avec le temps, l'a-naphtol et le KOH peuvent réagir pour donner une couleur semblable à celle du cuivre.

- Des périodes d’incubation plus courtes ou plus longues que 48 heures peuvent donner lieu à des résultats faussement négatifs puisque la quantité d’acétoine accumulée est trop faible pour être détectée ou que l’acétoine sera encore réduite à 2,3-butanediol.

- Il convient de noter que certaines bactéries (p. ex., Hafnia alveii et Enterobacter) sont des VP variables lorsqu’elles sont cultivées à 37 °C, mais qu’elles sont positives lorsqu’elles sont cultivées à des températures plus basses (25 °C à 30 °C).