PCR : Polymerase Chain Reaction | Principe | Etapes

❍ La réaction en chaîne de la polymérase est une technique utilisée pour multiplier massivement l'ADN, afin de pouvoir l'analyser à l'aide d'autres techniques. Elle est basée sur la réplication de l'ADN, un processus que nos cellules utilisent normalement pour dupliquer leur matériel génétique avant de se diviser en deux cellules filles identiques.

Procédure

❍ Elle nécessite l'échantillon d'ADN à multiplier, une Taq polymérase thermostable, des amorces (Primers) avec lesquelles nous sélectionnons ce qui se multiplie, et des nucléotides libres des 4 types - A, T, C et G :

1 - La première étape de la PCR est la dénaturation (Denaturation), ce qui signifie que nous chauffons nos ingrédients à exactement 96 degrés Celsius. Cela permet de rompre toutes les liaisons entre les deux brins d'ADN, afin qu'ils puissent se séparer l'un de l'autre.

2 - La deuxième étape s'appelle l’hybridation (Annealing). C'est là que nous avons besoin d'amorces. Pendant l'étape d'hybridation, nous refroidissons tout à environ 55 degrés Celsius, ce qui permet aux amorces de se lier à leurs séquences complémentaires sur l'ADN simple brin.

3 - La troisième étape est appelée élongation (Extension). Dans cette étape, nous utilisons une enzyme appelée Taq polymérase qui est obtenue à partir d'une bactérie : Thermus aquaticus qui se développe dans les sources chaudes géothermiques. Ainsi, non seulement la Taq polymérase peut résister à la chaleur pendant l'étape de dénaturation de la PCR, mais elle a une activité optimale à 72 degrés Celsius environ.

Ainsi, pendant l'extension, nous chauffons tout jusqu'à 72 degrés, et la Taq polymérase se fixe sur les amorces, saisit quelques nucléotides libres et assemble les nouveaux brins d'ADN.

Un cycle de PCR complet dure environ 10 minutes, et à la fin, nous avons doublé la quantité d'ADN car chaque brin d'ADN matrice est maintenant double brin. La PCR multiplie donc l'ADN à un rythme exponentiel - après environ 6 heures et 40 cycles, nous aurons théoriquement 2^40, ou 1 099 511 627 776 copies