Pseudomonas | Caractères bactériologiques | Culture | Identification | Antibiogramme

Introduction

Pseudomonas est un genre bactérien d'une importance clinique majeure, notamment en raison de sa capacité à provoquer des infections nosocomiales et sa résistance aux antibiotiques. Ces bactéries, omniprésentes dans l'environnement, sont particulièrement redoutées dans les milieux hospitaliers et chez les patients immunodéprimés. Cet article explore les caractéristiques bactériologiques, les méthodes de culture et d'identification, ainsi que les profils de résistance aux antibiotiques des Pseudomonas, en mettant l'accent sur Pseudomonas aeruginosa, l'espèce la plus pathogène.

Ⅰ. Généralité | Taxonomie

Le genre Pseudomonas appartient à la famille des Pseudomonadaceae et comprend un groupe hétérogène de bactéries en constante révision taxonomique. Grâce aux avancées en biologie moléculaire, de nombreuses espèces autrefois classées dans ce genre ont été reclassées dans d'autres genres (Burkholderia, Ralstonia, Comamonas, etc.).

Douze espèces de Pseudomonas sont fréquemment isolées dans des échantillons cliniques :

• Pseudomonas aeruginosa
• Pseudomonas fluorescens
• Pseudomonas stutzeri
• Pseudomonas putida
• Pseudomonas mendocina
• Pseudomonas monteilii
• Pseudomonas mosselii
• Pseudomonas oryzihabitans
• Pseudomonas pseudoalcaligenes
• Pseudomonas alcaligenes
• Pseudomonas luteola
• Pseudomonas veronii

Habitat et rôle pathogène

• Environnement : Présents dans les sols, l'eau et les zones humides, souvent sous forme de biofilms.
• Pathogénicité : P. aeruginosa est un pathogène opportuniste responsable d'infections nosocomiales, notamment chez les patients atteints de mucoviscidose.

Ⅱ. Caractères bactériologique

Examen Microscopique

• Morphologie : Bacilles à Gram négatif, aérobies, non sporulés, mobiles grâce à un ou plusieurs flagelles polaires.
• Taille : 0,5 à 1 µm de largeur et 2 à 7 µm de longueur.
• Souches mucoïdes : Fréquentes chez les patients atteints de mucoviscidose, elles produisent un exopolysaccharide (alginate) qui les protège de la phagocytose et des antibiotiques.

Souches mucoïdes : Fréquentes chez les patients atteints de mucoviscidose, elles produisent un exopolysaccharide (alginate) qui les protège de la phagocytose et des antibiotiques. Ces souches résultent de mutations dans le gène mucA et ont tendance à se regrouper ou à produire des filaments de bacilles courts à Gram négatif entourés d'un matériau rose plus foncé (exopolysaccharide d'alginate).

Coloration de Gram d'une souche mucoïde de Pseudomonas aeruginosa

Culture du Pseudomonas

• Conditions : Croissance facile entre 10°C et 42°C sur des milieux ordinaires (Mueller-Hinton) ou sélectifs (géloses Drigalski, Hektoën, MacConkey ou contenant du cétrimide).
• Croissance : Une bonne croissance est généralement obtenue après 24 à 48 heures d'incubation. Cependant, pour les cultures de patients atteints de mucoviscidose, il est recommandé de maintenir les boîtes de milieu solide à 35 à 37 °C pendant 5 jours, car certaines souches d'infections chroniques se développent très lentement.
• Morphologie des colonies :
• Les colonies de P. aeruginosa sont souvent plates, étalées, avec un bord dentelé et un éclat métallique, souvent associées à l'autolyse des colonies.
• Souches mucoïdes : Colonies lisses et brillantes, produisant un exopolysaccharide d'alginate.
• Variantes de petites colonies (SCV) : Croissance lente, hyperpiliées, adhérant aux surfaces de gélose et montrant des propriétés d'autoagrégation en milieu liquide.

Différentes morphologies de colonies de P. aeruginosa issues d'expectorations CF cultivées sur une gélose Conradi-Drigalski modifiée . M, mucoïde ; NM_1, colonie non mucoïde 1 (vert foncé) ; NM_2, colonie non mucoïde 2 (vert clair); SCV, variante de petite colonie. ( Source : 10.1128/9781555817381.ch42.f1 )

Les pigments du pseudomonas

Pyoverdine : Pigment fluorescent jaune-vert produit par six espèces de Pseudomonas : P. aeruginosa, P. fluorescens, P. monteilii, P. mosselii, P. putida et P. veronii. En raison de ce pigment, ces espèces sont classées comme membres du groupe des pseudomonades fluorescentes.

Pyocyanine : Pigment bleu-vert spécifique à P. aeruginosa. La combinaison de pyocyanine et de pyoverdine donne une couleur vert vif. Cependant, certaines souches de P. aeruginosa ne produisent que de la pyoverdine, ce qui peut rendre difficile leur différenciation des autres pseudomonades fluorescentes.

Autres pigments :

• Pyomélanine : Pigment brun noir.
• Pyorubine : Pigment rouge.

Source : @superteclab | ✔Piocyanine; Pigment bleu | ✔Pioverdine (fluorescéine); de couleur jaune verdâtre | ✔Pyorubine; coloration rouge. | ✔Pyomélanine; Sa couleur est brune. |

Odeur caractéristique : P. aeruginosa produit souvent une molécule aromatique (o-aminoacétophénone) ayant une odeur d'acacia, ce qui facilite son identification.

Ⅲ. Identification du pseudomonas et différenciation entre les espèces

1. Pseudomonas aeruginosa

La plupart des organismes P. aeruginosa sont facilement reconnaissables sur la base de :

• Morphologie des colonies : Plates, étalées, avec un bord dentelé et un éclat métallique.
• Production de pigments : Pyocyanine (pigment bleu-vert) et pyoverdine (pigment fluorescent vert).
• Odeur caractéristique : Odeur d'acacia.
• Capacité à se développer : Croissance à 42°C.
• Test de l'oxydase : Positif (présence de cytochrome C oxydase).
• Catalase : Positive.
• Enzymes réductrices :
  • Présence d'une nitrate réductase et d'une nitrite réductase.
  • Réduction des nitrates (NO₃) en monoxyde d'azote (NO) puis en azote (N₂).
• Test du fer triple sucre (TSI) : Réaction alcaline, sans production de gaz ni d'hydrogène sulfuré (H₂S).
• Arginine déiminase : Positive (ADH positive).

Pseudomonas aeruginosa sur une gélose TSI (source :ASM jounals).

2. Pseudomonas fluorescens / Pseudomonas putida

• P. fluorescens et P. putida ne possèdent pas de morphologie ou d'odeur de colonie distinctive.
• Leur incapacité à réduire les nitrates en azote gazeux et leur capacité à produire de l'acide à partir du xylose les distinguent des autres Pseudomonas.

P. fluorescens peut être différencié de P. putida par :

• Sa capacité à croître à 4°C.
• Son hydrolyse de la gélatine (bien que seulement 39 % des isolats hydrolysent la gélatine en 24 à 48 heures selon l'API 20NE, version 7.0 ; bioMérieux, Inc., Durham, NC).

Pseudomonas fluorescens incubé avec des bandes de gélatine (source :ASM jounals).

3. Pseudomonas stutzeri

• P. stutzeri peut se développer en présence de 6,5 % de NaCl.
• Sa capacité à réduire les nitrates en azote gazeux et à oxyder le glucose (mais pas le lactose) le distingue des autres Pseudomonas.
• Morphologie distinctive des colonies : sèches et ridées, avec un diamètre de 1 à 6 mm.

Pseudomonas fluorescens incubé avec des bandes de gélatine (source :ASM jounals).

Caractéristiques biochimiques des espèces de Pseudomonas trouvées dans les échantillons cliniques(source: manual of clinical microbiology).

Ⅳ. Sensibilité aux antibiotiques et traitement des pseudomonas

❏ Les antibiotiques habituellement actifs contre P. aeruginosa sont peu nombreux et d'usage hospitalier :

ß-lactamines : pipéracilline et ticarcilline, avec ou sans inhibiteur, ceftazidime, céfépime, aztréonam, imipénème, méropénème, doripénème, Aminosides (sauf la kanamycine) , Fluoroquinolones : ciprofloxacine et lévofloxacine, colistine et fosfomycine

❏ P. aeruginosa présente une résistance naturelle à de nombreux antibiotiques :

- Pénicillines G, A, M , Céphalosporines de 1re et de 2e génération, oxymino céphalosporines (céfotaxime, ceftriaxone), céphalosporines orales à large spectre , Ertapénème , Cyclines incluant la tigécycline , Macrolides , Kanamycine , Quinolones anciennes , Rifampicine , Chloramphénicol , Triméthoprime , Cotrimoxazole , Glycopeptides , Acide fusidique.

- Contrairement à des espèces proches comme P. fluorescens et P. putida, le bacille pyocyanique est naturellement résistant à plusieurs aminosides dont la kanamycine en raison de la production d’une phosphotransférase APH(3’)-IIb , cette caractéristique peut être utile dans l’identification

Ⅴ. Antibiotiques à tester "Pseudomonas "

❏ L'antibiogramme du pseudomonas est réalisé sur gélose de Mueller-Hinton, Inoculum : 0,5 McFarland

☰ Antibiogramme du Pseudomonas selon la Standardisation Algérienne

Ticarcilline (75µg) , Ticarcilline + acide clavulanique (75/10 µg), Pipéracilline (100 µg), Céftazidime (30µg) , Aztréonam (30µg) , lmipénème (10µg) , Amikacine (30µg) , Gentamicine (10 µg) , Tobramycine (10 µg) , Nétilmicine (30µg), Ciprofloxacine (5µg) , Lévofloxacine (5 µg) , Fosfomycine (CMI) , Colistine ( 10 µg)

☰ Antibiogramme du Pseudomonas selon CASFM

Liste standard : Ticarcilline , Ticarcilline - acide clavulanique , Pipéracilline , Pipéracilline - tazobactam , Ceftazidime , Céfépime , Ceftolozane-tazobactam , Imipénème , Méropénème , Tobramycine , Amikacine , Ciprofloxacine , Aztréonam , Gentamicine

Liste complémentaire : Nétilmicine , Lévofloxacine , Colistine , Fosfomycine , Ceftazidime-avibactam