Goutte Épaisse
Contenu :
◉ Introduction
La méthode de la goutte épaisse est une technique utilisée en microscopie pour détecter les parasites dans le sang, particulièrement utile pour des infections telles que le paludisme.
La préparation correcte de la goutte épaisse et le respect des étapes de séchage et de lyse des GR sont essentiels pour obtenir des résultats fiables lors de l'examen microscopique.
◉ Procédure
1. Source de l'échantillon
L'échantillon est généralement du sang total frais collecté par piqûre au doigt ou du sang total contenant de l'EDTA collecté par ponction veineuse dans l'heure suivant le prélèvement.
L'héparine ou le citrate de sodium peuvent être utilisés comme anticoagulant si des trypanosomes ou des microfilaires sont suspectés.
Sang de piqûre au doigt
- Essuyer la première goutte de sang.
- Toucher une goutte de sang avec une lame de microscope propre et la faire tourner pour former un cercle de 1,8 à 2,0 cm.
- Vérifier que le texte peut être lu à travers le film. Si nécessaire, étendre le cercle avec une deuxième lame ou un bâtonnet.
- Continuer à remuer pendant 30 secondes pour éviter la formation de fibrines.
Sang de ponction veineuse
- Placer une goutte de sang (30 à 40 µl) sur une lame de microscope propre.
- Étendre la goutte en un cercle de 1,8 à 2,0 cm.
- Vérifier que le texte peut être lu à travers le film. Si nécessaire, utiliser plusieurs petites gouttes de sang (3 à 4 petites gouttes) et les regrouper.
Note : S'il est trop épais, il pourrait s'écailler en séchant ou se détacher lors de la coloration. S'il est trop fin, la quantité de sang disponible pour l'examen est insuffisante pour détecter une parasitémie de faible niveau.
2. Séchage
- Laisser le film sécher à l'air libre, horizontalement et à l'abri de la poussière, pendant 6 à 8.
- Ne pas utiliser de chaleur pour accélérer le séchage.
3. Fixation
- Ne pas fixer la goutte épaisse.
- Si des lames minces et épaisses sont réalisées sur la même lame, éviter le contact du méthanol avec la goutte épaisse.
4. Coloration des lames (Giemsa à 10 %)
- Versez délicatement la solution de colorant jusqu’à ce que chaque lame soit recouverte.
- Réglez la minuterie sur 8–10 minutes.
- À la fin du temps de coloration, éliminez doucement le colorant en ajoutant goutte à goutte de l'eau tamponnée jusqu'à ce qu'il ne reste plus de colorant.
- Une fois le colorant éliminé, mettez les lames sur le râtelier pour les égoutter et les faire sécher en position verticale avec la goutte épaisse vers le bas.
Note :
- Si la coloration avec le Giemsa est retardée de plus de 3 jours ou si la coloration avec Wright est utilisée, placer la goutte épaisse dans de l'eau tamponnée (pH 7,0 à 7,2) pendant 10 minutes, puis laisser sécher à l'air libre, goutte vers le bas.
- Certains parasites et formes de parasites sont difficiles à différencier sans utiliser un film mince, ce qui nécessite souvent une double vérification pour une identification précise.
- Un excès de colorant peut masquer les parasites et rendre leur détection plus compliquée
4. Examen microscopique d’une goutte épaisse
Placement de la lame :
- Placez l’étalement de sang coloré au Giemsa sur la platine du microscope, avec l’étiquette du côté gauche.
- Positionnez la goutte épaisse sous l’objectif 10x.
Réglage du microscope :
- Allumez le microscope et réglez la lumière pour obtenir un éclairage optimal.
-
Faites la mise au point en regardant à travers l’oculaire et l’objectif 10x.
Recherche de parasites :
- Inspectez la lame pour la présence de parasites et d’éléments sanguins.
- Sélectionnez la zone de l’étalement bien colorée avec une répartition homogène des leucocytes.
Application de l’huile à immersion
- Déposez une petite goutte d’huile à immersion sur la goutte épaisse.
- Assurez-vous que l’applicateur de l’huile à immersion ne touche pas la lame pour éviter toute contamination croisée.
- Ne laissez pas l’objectif 40x entrer en contact avec l’huile.
Utilisation de l’objectif 100x :
- Placez l’objectif 100x à immersion au-dessus de la zone sélectionnée de la goutte épaisse.
- Utilisez la vis de mise au point fine pour obtenir une image nette.
- Remontez la platine mécanique pour éviter d’endommager la lame.
Vérification de l’épaisseur :
- Avec la vis de mise au point fine, réglez le microscope pour examiner les éléments cellulaires.
- Vérifiez que la zone de la goutte épaisse convient à un examen de routine : une densité de 15 à 20 leucocytes par champ indique une épaisseur satisfaisante.
- Les étalements ayant moins de leucocytes par champ nécessiteront un examen plus approfondi.
Examen systématique :
- Soyez systématique dans l’examen de la lame.
- Commencez par la partie supérieure gauche de l’étalement.
- Examinez chaque champ en déplaçant la lame horizontalement vers la droite.
Déplacement sur la lame :
- Lorsque vous atteignez l’autre extrémité de la lame, déplacez-la légèrement vers le bas, puis à gauche, champ par champ.
- Continuez ainsi pour couvrir toute la surface de la goutte épaisse.
- Réglez en permanence la mise au point fine pour chaque champ examiné.
5. Numération des parasites sur une goutte épaisse
Détection des parasites
- Si vous détectez des parasites du paludisme, comptez uniquement les formes asexuées (dans des cas d’infections mixtes ou uniques) sans compter les stades sexués (gamétocytes), que l’on ne comptabilise pas mais que l’on signale.
- Dans les cas d’infections mixtes, comptez tous les parasites asexués ensemble et signalez la présence de différentes espèces.
Début du comptage :
- En commençant par le haut de l’étalement, cherchez un champ avec un regroupement de leucocytes de bonne taille et commencez à les dénombrer.
Utilisation d'un compteur manuel
- Utilisez un compteur manuel multiple pour compter les parasites et les leucocytes simultanément
Comptage systématique des champs
- Après avoir dénombré tous les parasites et tous les leucocytes dans un champ, passez au champ suivant en suivant un cheminement systématique, en veillant à ne pas chevaucher les champs.
Décision d'arrêt du comptage
Arrêtez de compter selon les règles suivantes :
- Si, après avoir compté 200 leucocytes, vous avez trouvé 100 parasites ou plus, arrêtez de compter et enregistrez le résultat sous la forme du nombre de parasites pour 200 leucocytes.
- Si, après avoir compté 500 leucocytes, vous avez trouvé 99 parasites ou moins, arrêtez de compter et enregistrez le résultat sous la forme du nombre de parasites pour 500 leucocytes.
Calcul de la densité parasitaire
- Calculez la densité parasitaire sur la base de la numération leucocytaire réelle du patient. Si celle-ci n'est pas disponible, utilisez une moyenne de 8000 leucocytes/µl.
- Utilisez la formule suivante pour le calcul :
Parasites/µl de sang = Nombre de parasites comptés × 8000 leucocytes/µl / Nombre de leucocytes comptés