La Goutte Épaisse : Détection des Parasites Sanguins en Microscopie

◉ Introduction

La goutte épaisse est une technique de microscopie largement utilisée pour détecter les parasites dans le sang, en particulier dans le diagnostic du paludisme, de la trypanosomose et de la filariose. Contrairement au frottis mince, la goutte épaisse permet d'examiner un volume plus important de sang, ce qui augmente la sensibilité de détection, notamment en cas de faible parasitémie. Cette méthode est particulièrement utile dans les régions endémiques où les ressources sont limitées.

Cependant, la réussite de cette technique dépend d'une préparation minutieuse, d'un séchage approprié et d'une coloration optimale. Cet article détaille la procédure étape par étape, ainsi que des conseils pratiques pour éviter les erreurs courantes.

◉ Matériel Nécessaire

• Lames de microscope propres et sèches
• Lancettes stériles ou tubes contenant de l'EDTA pour prélèvement sanguin
• Colorant Giemsa (10 %)
• Eau tamponnée (pH 7,0 à 7,2)
• Huile à immersion
• Microscope optique (objectifs 10x, 40x et 100x)
• Compteur manuel pour parasites et leucocytes

◉ Procédure

1. Source de l'échantillon

Sang de piqûre au doigt

• Essuyer la première goutte de sang.
• Toucher une goutte de sang avec une lame de microscope propre et la faire tourner pour former un cercle de 1,8 à 2,0 cm.
• Vérifier que le texte peut être lu à travers le film. Si nécessaire, étendre le cercle avec une deuxième lame ou un bâtonnet.
• Nettoyez le doigt avec un antiseptique et laissez sécher.
• Utilisez une lancette stérile pour prélever une goutte de sang.
• Essuyez la première goutte avec une compresse stérile.
• Prélevez une deuxième goutte et déposez-la sur une lame de microscope propre.
• Étalez la goutte en un cercle de 1,8 à 2,0 cm de diamètre en utilisant un mouvement circulaire doux.
• Continuer à remuer pendant 30 secondes pour éviter la formation de fibrines.
• Vérifiez que le film est suffisamment fin pour permettre la lecture d'un texte à travers.

Sang de ponction veineuse

• Prélevez du sang dans un tube contenant de l'EDTA.
• Déposez 30 à 40 µl de sang sur une lame de microscope propre.
• Étalez la goutte en un cercle de 1,8 à 2,0 cm de diamètre.
• Si nécessaire, utiliser plusieurs petites gouttes de sang (3 à 4 petites gouttes) et les regrouper.

• Une goutte trop épaisse peut se craqueler ou se détacher lors de la coloration.
• Une goutte trop fine peut ne pas contenir suffisamment de sang pour détecter une parasitémie faible.
• L'héparine ou le citrate de sodium peuvent être utilisés comme anticoagulant si des trypanosomes ou des microfilaires sont suspectés.

2. Séchage

• Laissez sécher la goutte épaisse à l'air libre, à température ambiante.
• Ne pas utiliser de chaleur pour accélérer le séchage.

3. Fixation

• Ne pas fixer la goutte épaisse.
• Si des frottis minces et épaisses sont réalisées sur la même lame, éviter le contact du méthanol avec la goutte épaisse.

4. Coloration (Giemsa à 10 %)

• Recouvrez la lame avec la solution de Giemsa à 10 %.
• Laissez agir pendant 8 à 10 minutes.
• Rincez délicatement la lame avec de l'eau tamponnée (pH 7,0 à 7,2) jusqu'à ce que l'excès de colorant soit éliminé.
• Placez la lame sur un râtelier pour sécher à la verticale, goutte épaisse vers le bas.

Note :

• Un excès de colorant peut masquer les parasites, tandis qu'une coloration insuffisante peut les rendre invisibles.
• Certains parasites et formes de parasites sont difficiles à différencier sans utiliser un frottis mince, ce qui nécessite souvent une double vérification pour une identification précise.

4. Examen microscopique d’une goutte épaisse

Placement de la lame :

• Placez la lame sur la platine du microscope.
• Utilisez l'objectif 10x pour localiser la zone de la goutte épaisse.

Réglage du microscope et recherche de parasites

• Passez à l'objectif 40x pour une observation plus détaillée.
• Déposez une goutte d'huile à immersion sur la zone à examiner.
• Utilisez l'objectif 100x à immersion pour identifier les parasites.
• Ajustez la mise au point fine pour obtenir une image nette.

Vérification de l’épaisseur :

• Une densité de 15 à 20 leucocytes par champ indique une épaisseur appropriée.
• Si la densité est trop faible, examinez davantage de champs pour augmenter les chances de détection.

5. Numération des Parasites

Comptage des Parasites

• Comptez uniquement les formes asexuées des parasites (trophozoïtes et schizontes) dans le cas du paludisme.
• Signalez la présence de gamétocytes, mais ne les incluez pas dans le décompte.

Début du comptage :

• En commençant par le haut de l’étalement, cherchez un champ avec un regroupement de leucocytes de bonne taille et commencez à les dénombrer.

Utilisation d'un compteur manuel

• Utilisez un compteur manuel multiple pour compter les parasites et les leucocytes simultanément

Comptage systématique des champs

• Après avoir dénombré tous les parasites et tous les leucocytes dans un champ, passez au champ suivant en suivant un cheminement systématique, en veillant à ne pas chevaucher les champs.

Décision d'arrêt du comptage

Comptez les parasites et les leucocytes dans chaque champ jusqu'à atteindre 200 leucocytes (si la parasitémie est élevée) ou 500 leucocytes (si la parasitémie est faible).

• Si, après avoir compté 200 leucocytes, vous avez trouvé 100 parasites ou plus, arrêtez de compter et enregistrez le résultat sous la forme du nombre de parasites pour 200 leucocytes.
• Si, après avoir compté 500 leucocytes, vous avez trouvé 99 parasites ou moins, arrêtez de compter et enregistrez le résultat sous la forme du nombre de parasites pour 500 leucocytes.

Calcul de la densité parasitaire

• Calculez la densité parasitaire sur la base de la numération leucocytaire réelle du patient. Si celle-ci n'est pas disponible, utilisez une moyenne de 8000 leucocytes/µl.
• Utilisez la formule suivante pour le calcul :

◉ Conclusion

La méthode de la goutte épaisse reste un outil essentiel pour le diagnostic des infections parasitaires, en particulier dans les régions où les ressources sont limitées. Une préparation minutieuse, une coloration appropriée et un examen systématique sont les clés pour obtenir des résultats fiables. Bien que cette technique présente certaines limites, elle demeure une méthode de choix pour la détection des parasites sanguins.