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Coloration de Ziehl-Neelsen: Principe, Procédure, Interprétation
La coloration de Ziehl-Neelsen (ZN) est l'une des techniques de coloration les plus utilisées pour détecter les Mycobacterium tuberculosis, également connu sous le nom de bacille de Koch, la bactérie responsable de la tuberculose (TB).
◉ Définition
La méthode de choix pour la bacilloscopie des frottis d'expectoration est la coloration de Ziehl-Neelsen (ZN) car elle est la seule à fournir régulièrement de bons résultats sans nécessiter un équipement spécial.
Lorsque l'échantillon suspecté de contenir Mycobacterium tuberculosis est prélevé, il est fixé sur une lame de microscope, puis coloré et observé sous microscope. Les mycobactéries, si présentes, apparaissent comme des bâtonnets rouges ou roses caractéristiques.
Les techniques de coloration à froid, telles que les méthodes de Kinyoun ou de Tan Thiam Hok, ne sont pas recommandées. Il est prouvé qu'elles permettent difficilement la détection de bacilles acido-alcoolo-résistants (BAAR) dans les échantillons paucibacillaires et que la coloration s'affaiblit rapidement.
◉ Préparation des colorants
1. Solutions d'agent colorant
Carbol fuchsine de Ziehl (solution A):
- Solution stock de fuchsine alcoolique à 3 %
Fuchsine basique........ 3 g
Alcool 95 %.....jusqu'à 100 ml
- Placer la quantité requise de fuchsine dans un flacon (ou dans un cylindre) gradué et ajouter la quantité d'éthanol ou d'alcool méthyle nécessaire pour obtenir un volume total de 100 ml ; bien agiter jusqu'à dissolution complète.
- De petites quantités de cette solution doivent être filtrées préalablement à la coloration.
Solution aqueuse de phénol: (solution B):
Cristaux de Phénol ...................... 5 g
Eau distillée, si possible..... jusqu'à 90 ml
- Avant d'ajouter l'eau, liquéfier les cristaux de phénol dans un flacon en les chauffant légèrement.
Pour préparer la solution de travail de fuchsine phéniquée de Ziehl, mélanger 10 ml de la solution A à 90 ml de la Solution B.
2. Solutions d'agent décolorant
Solution alcool-acide:
Alcool 95 % ............................ 970 ml
Acide chlorhydrique concentré (35 %)..... 30 ml
- Ou quand l'alcool n'est pas disponible :
Solution aqueuse d'acide sulfurique à 25 %:
Eau, distillée si possible..... ........300 ml
Acide sulfurique concentré ............ 100 ml
- Placer 300 ml d'eau dans un flacon d'un litre du type Erlenmeyer. Ajouter lentement 100 ml d'acide sulfurique concentré en le laissant couler le long de la paroi du flacon. Le mélange va chauffer.
Ne jamais mettre l'eau dans l'acide sulfurique concentré , ceci peut provoquer des éclaboussures explosives.
3. Solution de contre-coloration au bleu de méthylène
Chlorure de bleu de méthylène. . . . . . . 0,3 g
Eau, distillée si possible . .... jusqu'à 100 ml
◉ Principe de coloration de ziehl neelsen
La présence d'acides mycoliques dans les parois cellulaires des bactéries acido-alcoolo-résistantes est la base cytologique de cette coloration. L'acide mycolique donne à ces bactéries une plus grande affinité pour le colorant primaire et une résistance à la décoloration par une solution d'acide-alcool.
La fuchsine est utilisé comme colorant primaire parce qu'elle est liposoluble et pénètre la paroi cellulaire cireuse. La coloration est encore améliorée en chauffant jusqu'à émission de vapeur la préparation pour faire fondre la cire et permettre au colorant de se déplacer dans la cellule.
Le mélange acide-alcool est utilisé pour décolorer les cellules non acido-alcoolo-résistantes. Une contre-coloration, telle que le bleu de méthylène, est ensuite appliquée. Une fois terminées, les bactéries acido-alcoolo-résistantes sont colorées en rouge-violet sur un fond bleu.
◉ Les étapes de la coloration de ziehl neelsen
Etaler l'expectoration régulièrement sur la zone centrale de la lame grâce à un mouvement continu de rotation ; on recommande un étalement d'environ 20 mm sur 10mm .
Placer les lames sur le séchoir avec la surface d'étalement vers le haut et laisser sécher à l'air durant environ 30 minutes
Procéder à la fixation des lames séchées en les tenant avec une pince et en les passant sur la flamme 5 fois pendant environ 4 secondes, la face d'étalement tournée vers le haut. Ne pas fixer par la chaleur les lames humides et éviter un échauffement excessif.
☲ Coloration :
❶ Placer les lames fixées sur le support de coloration selon leur numéro d'ordre, la face d'étalement vers le haut. Les lames devraient être séparées par un intervalle d'1 cm et ne jamais se toucher l'une l'autre.
❷ Recouvrir les lames l'une après l'autre au moyen de la solution de travail de fuchsine phéniquée de Ziehl à 0,3 % filtrée
❸ En plaçant une bande de papier absorbant comme un papier filtre ou même du papier journal, on retiendra la solution de coloration et on évitera le dépôt de cristaux de fuchsine sur le frottis.
❹ Chauffer les lames par le dessous au moyen de la flamme d'un bec Bunsen, d'une lampe à alcool ou d'un tampon d'ouate imbibé d'alcool, jusqu'à émission de vapeur. Il ne faut jamais aller jusqu'à l'ébullition de la solution de colorant. Ne pas laisser le colorant se dessécher
❺ Laisser les lames recouvertes d'une solution chaude et fumante de fuchsine phéniquée pendant 5 minutes en repassant la flamme si c'est nécessaire
❻ Rincer les lames délicatement à l'eau pour écarter l'excès de fuchsine phéniquée
❼ Evacuer l'excès d'eau de rinçage des lames . Les frottis d'expectoration ont une couleur rouge.
☲ Décoloration :
❶ Recouvrir les lames au moyen d'acide sulfurique à 25 % ou d'une solution d'alcoolacide et laisser agir pendant 3 minutes, après cela la coloration rouge devrait avoir presque disparu .En cas de nécessité, répéter cette séquence durant deux minutes supplémentaires.
❷ Laver délicatement l'acide sulfurique ou l'alcool-acide et l'excès de colorant à l'eau . Evacuer des lames l'excès d'eau de rinçage.
☲ Contre-coloration :
❶ Recouvrir les lames l'une après l'autre avec la solution de contre-coloration (bleu de méthylène à 0,3 %) et laisser agir pendant 1 minute
❷ Rincer les lames à l'eau individuellement
❸ Evacuer l'eau des lames et les laisser sécher à l'air
1. Recouvrir les lames par de fuchsine phéniquée
2. Chauffer les lames par le dessous
3. Rincer
4. Evacuer l'excès d'eau de rinçage
5. Recouvrir les lames au moyen d'acide sulfurique
6. Rincer
7. Evacuer l'excès d'eau de rinçage
8. contre-coloration (bleu de méthylène à 0,3 %).
9. Rincer
Résultat final
Qualité de l'étalement et de la coloration "Ziehl-Neelsen":
☰ L'aspect d'un frottis coloré correctement est bleu clair sous l'effet du bleu de méthylène. Si la couleur est bleu foncé, le frottis est trop épais, dans ces conditions il n'est pas possible de lire un texte au travers de la lame
◉ Conclusion
En conclusion, la coloration de Ziehl-Neelsen demeure une méthode importante dans le domaine de la microbiologie, en particulier pour la détection des bacilles acido-alcoolo-résistants tels que Mycobacterium tuberculosis.
Bien que d'autres méthodes aient émergé, la Ziehl-Neelsen conserve sa place prédominante en raison de sa simplicité, de sa fiabilité et de son coût relativement bas.
