❖ La méthode de choix pour la bacilloscopie des frottis
d’expectoration est la
coloration de Ziehl-Neelsen (ZN) car elle est la seule à
fournir régulièrement
de bons
résultats sans nécessiter un équipement spécial.
❖ Les techniques de coloration à froid comme les méthodes de Kinyoun
ou de Tan
Thiam Hok ne sont pas recommandées : il est prouvé qu’elles ne permettent que
difficilement la détection de bacilles acido-alcoolo-résistants
(BAAR) dans
les échantillons paucibacillaires et que la coloration pâlit rapidement.
A- Coloration de Ziehl-Neelsen : préparation des colorants
❶ Solutions d’agent colorant:
Carbol fuchsine de Ziehl (solution A):
- Solution stock de fuchsine alcoolique à 3 %
Fuchsine basique........ 3 g
Alcool 95 %.....jusqu’à 100 ml
- Placer la quantité requise de fuchsine dans un flacon (ou dans un cylindre)
gradué et ajouter la quantité d’éthanol ou d’alcool méthyle nécessaire pour obtenir
un
volume total de 100 ml ; bien agiter jusqu’à dissolution complète.
- De petites quantités de cette solution doivent être filtrées préalablement à la
coloration.
Solution aqueuse de phénol: (solution B):
Cristaux de Phénol ...................... 5 g
Eau distillée, si possible..... jusqu’à 90 ml
- Avant d’ajouter l’eau, liquéfier les cristaux de phénol dans un flacon en les
chauffant légèrement.
Pour préparer la
solution de travail
de fuchsine phéniquée de Ziehl, mélanger 10
ml
de la solution A à 90 ml de la Solution B.
❷ Solutions d’agent décolorant:
Solution alcool-acide:
Alcool 95 % ............................ 970 ml
Acide chlorhydrique concentré (35 %)..... 30 ml
- Ou quand l’alcool n’est pas disponible :
Solution aqueuse d’acide sulfurique à 25 %:
Eau, distillée si possible..... ........300 ml
Acide sulfurique concentré ............ 100 ml
- Placer 300 ml d’eau dans un flacon d’un litre du type Erlenmeyer. Ajouter
lentement
100 ml d’acide sulfurique concentré en le laissant couler le long de la paroi du flacon.
Le mélange va chauffer.
Ne jamais mettre
l’eau dans l’acide
sulfurique concentré , ceci peut
provoquer des éclaboussures explosives.
❸ Solution de contre-coloration au bleu de
méthylène:
Chlorure de bleu de méthylène. . . . . . . 0,3 g
Eau, distillée si possible . .... jusqu’à 100 ml
B- Principe de coloration de ziehl neelsen
- La présence d'acides mycoliques dans les parois cellulaires des
bactéries
acido-alcoolo-résistantes est la base cytologique de cette coloration. L'acide
mycolique donne à
ces bactéries une plus grande affinité pour le colorant primaire et une résistance à la
décoloration par une solution d’acide-alcool.
- La fuchsine est utilisé comme colorant primaire parce qu'elle est
liposoluble et pénètre la paroi cellulaire cireuse.La coloration est encore améliorée en
chauffant jusqu’à émission de vapeur la préparation pour faire fondre la cire et permettre au
colorant de se déplacer dans la cellule.
- Le mélange acide-alcool est utilisé pour décolorer les cellules non
acido-alcoolo-résistantes. Une contre-coloration, telle que le bleu de méthylène, est ensuite
appliquée.
Une fois terminées, les bactéries acido-alcoolo-résistantes sont colorées en rouge-violet sur un
fond bleu.
C- Les étapes de la coloration de ziehl neelsen
- Etaler l’expectoration régulièrement sur la zone centrale de la lame grâce à un
mouvement continu de rotation ; on recommande un étalement d’environ 20 mm sur 10mm .
- Placer les lames sur le séchoir avec la surface d’étalement vers le haut et laisser
sécher à l’air durant environ 30 minutes
- Procéder à la fixation des lames séchées en les tenant avec une pince et en les passant
sur la flamme 5 fois pendant environ 4 secondes, la face d’étalement tournée vers le
haut. Ne pas fixer par la chaleur les lames humides et éviter un
échauffement
excessif.
☲ Coloration :
❶ Placer les lames fixées sur le support de coloration selon
leur
numéro d’ordre, la face
d’étalement vers le haut. Les lames devraient être séparées par un intervalle d’1 cm et
ne jamais se toucher l’une l’autre.
❷ Recouvrir les lames l’une après l’autre au moyen de la
solution
de travail de fuchsine
phéniquée de Ziehl à 0,3 % filtrée
❸ En plaçant une bande de papier absorbant comme un papier
filtre
ou même du papier
journal, on retiendra la solution de coloration et on évitera le dépôt de cristaux de
fuchsine sur le frottis.
❹ Chauffer les lames par le dessous au moyen de la flamme
d’un bec
Bunsen, d’une
lampe à alcool ou d’un tampon d’ouate imbibé d’alcool, jusqu’à émission
de vapeur.
Il ne faut jamais aller jusqu’à l’ébullition de la solution de colorant. Ne pas laisser
le colorant se dessécher
❺ Laisser les lames recouvertes d’une solution chaude et
fumante de
fuchsine phéniquée
pendant 5 minutes en repassant la flamme si c’est nécessaire
❻ Rincer les lames délicatement à l’eau pour écarter l’excès
de
fuchsine phéniquée
❼ Evacuer l’excès d’eau de rinçage des lames . Les frottis
d’expectoration ont une
couleur rouge.
☲ Décoloration :
❶ Recouvrir les lames au moyen d’acide sulfurique à 25 %
ou
d’une
solution d’alcoolacide
et laisser agir pendant 3 minutes, après cela la coloration rouge devrait avoir presque
disparu .En cas de nécessité, répéter cette séquence durant deux minutes
supplémentaires.
❷ Laver délicatement l’acide sulfurique ou l’alcool-acide et
l’excès de colorant à l’eau
. Evacuer des lames l’excès d’eau de rinçage.
☲ Contre-coloration :
❶ Recouvrir les lames l’une après l’autre avec la solution
de
contre-coloration (bleu de
méthylène à 0,3 %) et laisser agir pendant 1 minute
❷ Rincer les lames à l’eau individuellement
❸ Evacuer l’eau des lames et les laisser sécher à l’air
1)Recouvrir les lames par de fuchsine phéniquée
2)Chauffer les lames par le dessous
3)Rincer
4)Evacuer l’excès d’eau de rinçage
5)Recouvrir les lames au moyen d’acide sulfurique
6)Rincer
7)Evacuer l’excès d’eau de rinçage
8)contre-coloration (bleu de
méthylène à 0,3 %)
9)Rincer
Résultat final
Qualité de l’étalement et de la coloration "Ziehl-Neelsen":
☰ L’aspect d’un frottis coloré correctement est bleu clair sous l’effet du bleu de
méthylène. Si la couleur est bleu foncé, le frottis est trop épais, dans ces conditions
il
n’est pas possible de lire un texte au travers de la lame