☰ Contenu :
- Ⅰ. Définition:
- Ⅱ. Activité de la protéinase K
- Ⅲ. Stabilité de la protéinase K
- Ⅳ. Applications de la protéinase K
- Ⅴ. Inhibition de la protéinase K
- Ⅵ. Quelle est la fonction de la proteinase k dans l'extraction d'ADN ?
🏾 Définition
La protéinase K est une enzyme protéolytique, non spécifique, à large spectre, très utilisée en biologie moléculaire pour inactiver les contaminants protéiques dans les échantillons préparés. Cette endopeptidase reste active sur une large plage de pH, optimale entre 6,5 et 9,5, et des températures relativement élevées, optimale 65 °C.
La protéinase K, également connu sous le nom de protéase K, est sécrétée par Tritirachium album Limber si cette moisissure est cultivée en présence de kératine, d'où la désignation "K", comme seule source d'azote.
Protéinase K = Protéine (longue chaîne d'acides aminés) + ase (suffixe pour enzyme) + K (kératine)
🏾 Activité de la protéinase K
La protéinase K est une sérine protéase à large spectre appartenant à la classe de la subtilisine (il existe deux types de sérine protéases, la chymotrypsine et la subtilisine). Cette enzyme appartient à la famille des peptidases S8. Le site prédominant de clivage est la liaison peptidique adjacente au groupe carboxyle des acides aminés aliphatiques et aromatiques avec des groupes alpha-amino bloqués.
L'ion calcium est le cofacteur de l'enzyme protéinase K, Les ions calcium n'affectent pas l'activité de l'enzyme mais contribuent à sa stabilité, si les ions calcium sont éliminés, la stabilité de l'enzyme est réduite, mais l'activité protéolytique est maintenue.
La digestion avec la protéinase K pour la purification des acides nucléiques est généralement effectuée en présence d' EDTA (nécessaire pour inhiber les enzymes dépendantes d’ions métalliques, telles que les nucléases).
🏾 Stabilité de la protéinase K
La protéinase K est stable sur une large plage de pH (de 4 à 12) et de température (de +37°C à +65°C). L'augmentation de la température de réaction de 37 °C à 50-60 °C peut augmenter plusieurs fois l'activité, en rendant ses sites de clivage du substrat plus accessibles, tout comme l'ajout de 0,5-1 % de dodécylsulfate de sodium (SDS) ou de chlorure de guanidinium (3 M), de thiocyanate de guanidinium (1 M ) et de l'urée (4 M).
🏾 Applications de la protéinase K
◉ La protéinase K est couramment utilisée en biologie moléculaire pour digérer les protéines, éliminer les contaminations et inactiver les DNases et RNases qui, autrement, dégraderaient un échantillon d'ADN ou d'ARN souhaité. La protéinase k convient à cette application car l'enzyme est active en présence de produits chimiques dénaturant les protéines tels que le SDS et l'urée, d'agents chélatants tels que l'EDTA, de réactifs à base de sulfure d'hydrogène et d'inhibiteurs de trypsine ou de chymotrypsine.
◉ Elle est utilisée pour la destruction des protéines dans les lysats cellulaires (tissus, cellules de culture cellulaire) et pour la libération des acides nucléiques
◉ La protéinase K est également utile pour caractériser les protéines : En raison de la spécificité de clivage de la protéinase K, des fragments caractéristiques de protéines sont obtenus qui sont utiles pour déterminer la structure et la fonction des protéines.
◉ La protéinase K est très utile dans l'isolement d'ADN ou d'ARN hautement natifs et non endommagés, car la plupart des DNases et RNases microbiennes ou mammifères sont rapidement inactivées par l'enzyme, en particulier en présence de 0,5 à 1 % de SDS.
🏾 Inhibition de la protéinase K
La protéinase K est inactivée par par chauffage à 95°C pendant 10 minutes, l'acide trichloroacétique (TCA) ou les inhibiteurs de la sérine protéase AEBSF, PMSF ou DFP
La protéinase K s’autolyse partiellement à faible concentration (< 0,01mg/mL), mais elle est bien stable à >1mg/mL.
🏾 Quelle est la fonction de la proteinase k dans l'extraction d'ADN ?
Lors de l'extraction de l'ADN (ou des acides nucléiques en général), de nombreuses protéines contaminantes sont présentes. La protéinase K est utilisée dans de nombreux protocoles d'extraction d'ADN pour digérer ces protéines contaminantes.
De plus, des nucléases (enzymes qui dégradent les acides nucléiques) peuvent être présentes. L'ajout de protéinase K dégrade ces nucléases et protège les acides nucléiques de l'attaque des nucléases.