🏾 Sommaire :
- Définition
- L’essai du contrôle de la biocharge
- Procedure et étapes
- Préparation des échantillons
- Méthodes
🏾 Bioburden / Biocharge
Le test de Bioburden , biocharge ou charge microbienne, est un terme utilisé pour décrire la présence et mesurer le niveau de micro-organismes viables sur une surface ou dans un dispositif spécifique avant la stérilisation.
La biocharge est la somme des contributions microbiennes d'un certain nombre de sources :
- Matières premières utilisées dans le processus de fabrication.
- Introduite via la main-d'œuvre ou l'environnement de l'assemblage / fabrication.
- Lors des processus de nettoyage et l'emballage du produit fini, etc.
La raison de la réalisation de test de Bioburden, varie et dépend du domaine et de l’application finale du produit testé. Les mesures qualitatives / quantitatives permettent de déterminer si les types et les nombres de micro-organismes présents sont satisfaisants ou non par rapport aux critères d'acceptation prédéfinis.
🏾 L’essai du contrôle de la biocharge
Le test de biocharge est conçu pour compter le nombre de micro-organismes (en tant qu'unités formant colonies, UFC) dans un produit ou une matière première non stérile. L’essai du contrôle de la biocharge se fait en utilisant différents milieux de cultures propices à la prolifération des bactéries et champignons. Le test est soit l'une ou les deux méthodes officinales DGAT ou DMLT, soit une alternative.
- Dénombrement des germes aérobies viables totaux : DGAT, DMLT
- DGAT : dénombrement des germes aérobies totaux, il s'agit d'une estimation des micro-organismes mésophiles aérobies viables qui peuvent être dérivés d'un milieu à usage général (la pharmacopée recommande un milieu digestion de caséine de soja ).
- DMLT : dénombrement des moisissures et levures totaux, il s'agit d'une estimation des champignons aérobies mésophiles (ressemblant à des levures et filamenteux, et ceux qui sont dimorphes). Le test utilise un milieu fongique à usage général (la pharmacopée recommande la gélose Saboraud dextrose ).
- Recherche des germes plus spécifiques
🏾 Procedure et étapes
L'estimation de la charge microbienne d'un dispositif médical se compose généralement de quatre étapes distinctes:
- Un échantillon du produit à tester est préparé en fonction des caractéristiques physiques du produit.
- Isolement, typiquement par filtration sur membrane, du micro-organismes à partir de l'échantillon puis culture.
- Dénombrement de l'échantillon de collection contenant les micro-organismes récupérés.
- Caractérisation de la charge microbienne. Les résultats sont enregistrés et un rapport est préparé, détaillant les résultats du test.
🏾 Préparation des échantillons
En général, l'étape de préparation de l'échantillon consiste à dissoudre ou à suspendre 10 ml ou 10 g de l'échantillon à tester dans un diluant bénin tel qu'une solution tamponnée de chlorure de sodium et de peptone à pH 7,0 ou un tampon phosphate à pH 7,2.
Habituellement, une dilution 1:10 est préparée, le pH de la préparation de l'échantillon doit être ajusté dans une plage de 6 à 8 à l'aide de solutions acides ou alcalines stériles. Lors du test d'un produit solide qui ne se dissout pas complètement dans le diluant choisi, le matériau peut être réduit en une poudre fine à l'aide, par exemple, d'un mortier et d'un pilon stériles, pour une meilleure dispersion de l'échantillon dans la solution tampon.
- Produits non gras insolubles dans l'eau : L'utilisation d'un agent émulsifiant tel que le polysorbate 80 à une concentration de 1 g/L de diluant est recommandée pour favoriser l'homogénéisation de la préparation de l'échantillon.
- Produits gras : Dissoudre le produit dans du myristate d'isopropyle ltérisé ou homogénéiser avec du polysorbate 80 stérile ou tout autre tensioactif stérile approprié. Si nécessaire, chauffer la préparation d'échantillon à 40 °C maximum (ou utiliser un diluant préchauffé).
- Fluides ou solides sous forme d'aérosols : Transférer aseptiquement le produit dans un récipient stérile pour un échantillonnage ultérieur. Bien que cela ne soit pas spécifié dans l'USP, on peut refroidir le récipient dans un mélange d'alcool et de neige carbonique pendant environ 1 h. Ensuite, à température ambiante et, en utilisant des techniques aseptiques, couper le récipient et laisser le propulseur s'échapper avant de prélever l'article.
- Dispositifs transdermiques : retirez les feuilles de protection et placez les unités de produit, face adhésive vers le haut, dans un récipient stérile de type grande boîte de Pétri. Couvrir le côté adhésif des unités de produit avec un matériau poreux stérile pour empêcher les unités de coller ensemble. Retirez aseptiquement chaque unité de produit et ajoutez-les au diluant de test contenant des inactivateurs appropriés tels que la lécithine et le polysorbate 80. Agiter la préparation de produit pendant au moins 30 min, avant de prélever l'aliquote d'échantillon pour le test.
🏾 Méthodes
En règle générale, le contrôle microbiologique des produits non stériles est réalisé soit par la méthode de filtration sur membrane, soit par la méthode de dénombrement sur plaque. La méthode du nombre le plus probable sera utilisée exceptionnellement, quand le dénombrement microbien ne peut être réalisé par l’une des deux premières, du fait de la nature du produit (corps gras) ou du nombre de MO présumé.
Filtration sur membrane
C'est la méthode de choix et elle doit être appliquée aux échantillons contenant des substances antimicrobiennes. Avec la méthode, l'échantillon est passé à travers un filtre à membrane avec une taille de pores de 0,45 μm ou moins. La membrane fonctionne comme une barrière et capture les micro-organismes plus gros que la taille des pores de la membrane.
Habituellement, le test mesure deux fluides de test de 10 ml chacun, en faisant passer chaque échantillon à travers un filtre séparé. Il est important de diluer le liquide d'essai prétraité si la concentration bactérienne est élevée, afin que 10 à 100 colonies puissent se développer par filtre
La membrane est transférée sur un milieu de culture () et placée dans un incubateur pendant au moins 5 jours à 30–35 °C pour la détection des bactéries et à 20–25 °C pour la détection des champignons. A la fin de la période d'incubation, le nombre de colonies est compté.
Techniques d'ensemencement directe (méthode de dénombrement sur plaque)
Les méthodes de placage direct pour les tests de biocharge comprennent la plaque de coulée et la plaque d'étalement. La méthode de la plaque de coulée est préférée en raison de sa plus grande précision théorique
1. Ensemencement en profondeur (boîte coulée)
Le milieu de culture stérilisé est ajouté à une boîte de Pétri contenant l'échantillon à tester et laissé se solidifier.
- Prélevez 1 mL du liquide de test ou sa dilution dans chaque boîte de Pétri de manière aseptique, ajoutez à chaque boîte 15 à 20 mL de milieu gélosé stérilisé, préalablement fondu et maintenu en dessous de 45 °C, et mélangez (45 °C est juste au-dessus du point de solidification pour minimiser la mort cellulaire induite par la chaleur).
- Pour la détection des bactéries, utilisez un milieu gélosé digéré à la caséine de soja et pour la détection des champignons, utilisez un milieu gélosé au glucose de Sabouraud, auquel un antibiotique a été préalablement ajouté.
- Une fois la gélose solidifiée, incuber au moins 5 jours à 30–35 °C pour la détection des bactéries et à 20–25 °C pour la détection des champignons.
2. Ensemencement par étalement en surface.
Placez 0,05 à 0,2 ml du liquide de test sur la surface solidifiée et séchée du milieu gélosé et étalez-le uniformément.
Méthode du nombre le plus probable
La méthode du nombre le plus probable (NPP) est une méthode quantitative utilisée pour déterminer la concentration bactérienne approximative dans un échantillon.
La méthode consiste à prendre la solution ou l'échantillon d'origine et à le subdiviser par ordres de grandeur (souvent 10 × ou 2 ×) en bouillon de culture et à évaluer la présence / l'absence de micro-organismes dans plusieurs subdivisions.
La principale faiblesse des méthodes NPP est le besoin d'un grand nombre de répétitions à la dilution appropriée pour réduire les intervalles de confiance. Le NPP n'est efficace que pour l'examen des bactéries, car il ne fournit pas de résultats fiables pour le dénombrement des champignons.
Pour déterminer l'exactitude et la sensibilité des méthodes d'essai utilisées pour les essais de limite microbienne, des échantillons de 10 g ou 10 ml du matériau d'essai sont examinés. Il faut s'assurer que la méthode de test n'introduit pas de bactéries dans l'échantillon ou ne tue pas les bactéries dans l'échantillon de test.
Note : La méthode du nombre le plus probable est moins utilisée pour des raisons de précisions, elle est réservée aux comptages bactériens lorsqu'aucune autre méthode n'est disponible. Cependant son emploi est recommandé pour les matières premières ayant peu de contamination microbienne.
🏾 Limites fixées pour les critères d’acceptations
Les limites fixées pour les critères d’acceptation s’établissent en considérant les facteurs suivants: la nature du produit utilisé, son utilisation, la voie d’administration et le type de patients visés (enfants, femmes enceintes, patients immunodéprimés).
Les limites ont été fixées en tenant compte de ces différents facteurs et sont les suivantes
- DGAT < 102 UFG/g ou UFC/mL
- DMLT < 101 UFC/g ou UFC/mL
- Les témoins de manipulations doivent être limpides et contenir 0 UFC/mL
