Test ONPG | Principe | Étapes | Résultats | Interpretation
✑ Dr. Belouahad l
☰ Sommaire :
Ⅰ. Introduction
La capacité des bactéries à fermenter le lactose dépend de deux enzymes, la perméase et la bêta-galactosidase.
La perméase permet au lactose de pénétrer dans la paroi cellulaire bactérienne, où il est ensuite décomposé en glucose et galactose par la bêta-galactosidase. Le glucose et le galactose peuvent alors être métabolisés par les bactéries.
Cependant, certains organismes manquent de perméase et apparaissent comme des fermenteurs tardifs ou non-fermenteurs .
☰ Le test ONPG est utilisé pour détecter l'enzyme β‐galactosidase, présente dans les fermenteurs tardifs du lactose (Les fermenteurs de lactose tardifs sont très difficiles à distinguer des non-fermenteurs de lactose car les deux apparaissent sous forme de colonies incolores sur la gélose MacConkey ).
Exemple : Enterobacter spp., à gauche, sont souvent des fermenteurs tardifs du lactose, et ainsi les colonies peuvent apparaître incolores à rose clair.
L'O-Nitrophényl-β-D-galactopyranoside (ONPG) est structurellement similaire au lactose (c'est-à-dire que l'ONPG est un analogue du lactose), sauf que l'orthonitrophényle a été substitué au glucose.
Ⅱ. Principe
L'O-nitrophényl-bêta-D-galactopyranoside (ONPG) est un substrat artificiel structurellement similaire au lactose à l'exception du fait que le glucose est substitué par un groupe o-nitrophényle. Contrairement au lactose, le substrat O-nitrophényl-bêta-D-galactopyranoside (ONPG) est capable de pénétrer dans la cellule bactérienne sans la présence de perméase.
Lors de l'hydrolyse, par l'action de l'enzyme β-galactosidase, l'ONPG se scinde en deux résidus, le galactose et l'o-nitrophénol. L'ONPG est un composé incolore : l'O-nitrophénol est jaune, fournissant une preuve visuelle de l'hydrolyse.
Ⅲ. Procédure
Les bactéries cultivées dans un milieu contenant du lactose (pour induire la production de l'enzyme galactosidase), comme la gélose au fer Kligler (KIA) ou la gélose Triple sucre au fer (TSI) , produisent des résultats optimaux dans le test ONPG.
☰ Dans la méthode de test en bouillon, l'organisme est prélevé dans un milieu contenant une concentration élevée de lactose et est inoculé dans le bouillon ONPG. Si l'organisme possède de la bêta-galactosidase, l'enzyme divisera la liaison bêta-galactoside, libérant de l'o-nitrophénol qui est un composé de couleur jaune. Cela indique un test positif.
☰ Dans la méthode du disque, l'organisme à tester est prélevé dans un milieu contenant une forte concentration de lactose. Une suspension dense (turbidité équivalente à un 3 McFarland ) est préparée. Un disque ONPG est ajouté à 0,5 ml de la suspension. Si l'organisme possède de la bêta-galactosidase, l'enzyme divisera la liaison bêta-galactoside, créant un changement de couleur jaune dans la suspension.
☰ Les organismes à forte activité bêta-galactosidase peuvent produire une réaction positive quelques minutes après l'ensemencement du milieu ONPG ; d'autres organismes peuvent prendre jusqu'à 24 heures.
Ⅳ. Bactéries ONPG positifs | Bactéries ONPG positifs
| O.N.P.G. POSITIF (couleur jaune) | O.N.P.G. NÉGATIF (incolore) |
| E. coli , Shigella dysenteriae 1 , Certaines souches de S. dysenteriae d’autres sérotypes et de S. boydii, Salmonella sous genre III (S. arizonae), Salmonella sous genre II *, Citrobacter, Levinea malonatica, Levinea amalonatica **, Klebsiella (sauf K. rhinoscleromatis), Enterobacter, Hafnia **, Serratia marcescens **, Serratia liquefaciens **, Serratia plymuthica, Serratia rubidaea, Erwinia carotovora, Yersinia **, Vibrio cholerae **, Plesiomonas | Alcalescens dispar , Autres Shigella, Salmonellasous genre I et IV, Edwardsiella, Proteus, Providencia, Vibrio parahaemolyticus |
* Tardivement, après 24 heures d’incubation. ** Hydrolysent l'O.N.P.G. grâce à une enzyme autre que la ß-galactosidase stricto sensu, c’est-à-dire inductible par Isopropyl-beta-D- thiogalactopyranoside (I.T.P.G.)
NB: Le test à l’O.N.P.G. peut avoir un intérêt pour d’autres genres bactériens ; par exemple, chez les Pseudomonas aeruginosa, les souches du sérogroupe O:11 sont à de rares exceptions près, O.N.P.G. (+) contrairement à celles des autres groupes O, chez les Neisseriaceae, N. lactamica est la seule espèce O.N.P.G. (+).